超声辅助提取螺旋藻多糖的实验研究

贲永光， 钟红茂， 李 康， 孔繁晟， 李文燕， 杨鼎隆

(1.广东药学院 药科学院，广东广州 510006;2.中国科学院南海海洋研究所，广东广州 510301)

螺旋藻多糖是从螺旋藻藻体、螺旋藻培养液中提取分离出来的一类具有促进细胞生长、提高免疫力作用、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、对核酸内切酶活性和DNA修复合成有增强作用等功能的重要天然生物活性物质，是国内外海洋药物研究开发的热点。螺旋藻多糖的主要成分有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖等，它们仅占细胞成分的2% ～3%，但却有着独特的生理功能和药用价值。螺旋藻多糖是由O-鼠李糖-甲基鼠李糖和O-己糖醛酸2种双糖重复组成，这种从螺旋藻中分离、纯化的水溶性多糖，可调节人体生理功能，促进细胞新陈代谢，增强机体免疫力。将在预防医学、临床医学、保健食品等方面发挥重大作用［1-5］。

本研究探讨利用超声提取技术手段对螺旋藻多糖进行提取研究，并与常规提取法进行比较。

1 材料

1.1 材料 螺旋藻购自市场(经中国科学院南海海洋研究所鉴定)，经晒干后进行粉碎至40目备用。葡萄糖对照品(分析纯，纯度≥99%，广州汕头市西陇化工厂)。

1.2 试剂 无水乙醇、95%乙醇、丙酮、苯酚、浓硫酸，以上试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器与设备 HH-6恒温水浴锅(江苏金坛市宏华仪器厂);RE-52CS旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪器厂);予华牌循环水真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂);UV1101紫外/可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司);AY120电子分析天平(日本岛津公司);KH-400KDB型高功率数控超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);摇摆式高速中药粉碎机(大德中药机械有限公司)。

2 试验方法

2.1 葡萄糖对照品溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖50.0 mg，置100 mL量瓶中，加蒸馏水溶解，稀释至刻度，摇匀。制成标准溶液(0.5 mg/mL)。

2.2 标准曲线制备 精密吸取葡萄糖对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 置50 mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密吸取上述各种质量浓度溶液2.0mL，另精密吸取蒸馏水2.0 mL作空白对照，置具塞试管中，加5%苯酚溶液1.0 mL，浓硫酸 5.0 mL 摇匀，于沸水浴中加热15 min，冷却，于490 nm波长测定吸收度值。结果见图。以吸收值A为纵坐标，质量浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程A=26 541C+0.011 3，r=0.997 7(n=6)。结果表明葡萄糖质量浓度在0.000 002 5～0.000 025 g/mL范围内与吸收值线性关系良好。

2.3 螺旋藻多糖的制备及定量测定 准确称取螺旋藻干粉5.00 g→放入圆底烧瓶，加入适量蒸馏水并混匀→按各种设定条件(时间、功率、固液比、温度)在超声波仪器内进行提取→离心、沉淀(3 000 r/min，10 min)→提取清液→浓缩至1/5→5倍95%乙醇沉淀→丙酮洗涤，加适量蒸馏水溶解，置100 mL量瓶中，稀释至刻度，精密吸取2 mL置50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密吸取溶液2.0 mL，另精密吸取蒸馏水2.0 mL作空白对照，置具塞试管中，加5%苯酚溶液1.0 mL，浓硫酸5.0 mL 摇匀，于沸水浴中加热 15 min，冷却，于490 nm波长测定吸收度值，测得多糖得率及质量。

2.4 螺旋藻多糖提取率EY的计算

式中，x0－提取前螺旋藻的质量，xt－提取多糖的质量

3 结果与讨论

3.1 单因素试验及结果 各个因素实验时，螺旋藻的投入量均为5.00 g。料液比为1∶20，超声波功率320 W，温度40℃，提取时间为30 min，考察某一个因素时，其他因素固定上述值。

3.1.1 考察超声作用时间对提取率的影响 从螺旋藻多糖提取结果(见图1)看，短时间(小于30 min)超声处理时提取率较低;延长处理时间至40 min，提取率快速增加并达到峰值(3.49%)。再增加时间，提取率则迅速下降。由于螺旋藻多糖主要存在于细胞间和细胞壁中，超声处理时间太短(小30 min)不足以破碎细胞，释放多糖;结果数据表明，作用时间在30～50 min，对多糖的提取效果较好。

图1 超声作用时间对螺旋藻多糖提取率的影响

3.1.2 考察超声功率对提取率的影响 见图2。图2表明，随着超声功率的提高，多糖的提取率随之增大，原因如下对于一定频率和一定发射面的超声来说，功率增大，声强随之增大。如果声强增大，声压幅值以及液体中压力亦增大，空化泡崩溃所需的时间将变得更短，也就是说单位时间内超声产生的空化时间增多，从而有利于植物药有效成分提取率的提高。在超声功率为200 W～280 W范围内，多糖提取率随超声功率的提高而增大，当超声功率为280 W时，多糖的提取率为3.34%。

图2 超声功率对螺旋藻多糖提取率的影响

3.1.3 考察提取温度对提取率的影响 见图3。

图3 提取温度对螺旋藻多糖提取率的影响

由图3可知，随着温度的升高，螺旋藻多糖的提取率也逐步上升，当提取温度达到60℃时，提取率达到最高并趋于平衡。升高温度有利于提取率的提高，一般来说，温度升高，溶剂的表面张力系数及黏滞系数下降，蒸汽压升高，超声空化阈值下降，有利于空化泡的产生，但是另一方面，由于蒸汽压的增大，导致空化强度或空化效应下降，从而不利于提取过程的强化。从超声空化引起对提取率提高的角度来说，应该在较低的温度条件下工作。

3.1.4 考察固液比对提取率的影响 见图4。

图4 固液比对螺旋藻多糖提取率的影响

由图4可知，溶剂用量的适当增大有利于多糖提取率的提高，当固液比达到1∶30以后，再提高固液比，多糖提取率增加不是那么明显。考虑到溶剂利用的经济效益以及后序工艺能耗问题，在合适的范围内选择较小的固液比较适宜。3.2 正交实验结果与分析 以超声提取时间、超声功率、固液比和提取温度为因素，每个因素设定3个水平设计(见表1)，考察超声提取螺旋藻多糖的工艺，结果见表2，表3。

表1 超声强化提取螺旋藻多糖的正交表头设计

表2 超声强化提取螺旋藻多糖的正交实验结果

表3 超声强化提取螺旋藻多糖的正交方差分析表

由表2、3可以看出，影响超声提取螺旋藻多糖的4个因素(温度、超声功率、提取固液比、提取时间)中，温度的影响最大，超声功率的影响最小，其影响多糖提取率的大小次序先后为:A＞C＞D＞B，即温度＞提取固液比＞提取时间＞超声功率。综合考虑经济效益的因素，得出各因素的优化工艺参数为:提取温度50℃，提取功率320 W，固液比1∶25，提取时间50 min。

3.3 验证实验 称取螺旋藻粉末5.00 g，在提取温度50℃，提取功率320 W，固液比1∶25，提取时间50 min条件下重复实验3次，分别测得螺旋藻多糖的提取率为3.287 6%、3.301 2%和3.297 2%，平均提取量为 3.295 3%，可见所确定的提取工艺能用于螺旋藻多糖的提取。

3.4 超声提取与常规提取法的对比研究 超声提取按3.2项的最佳提取工艺进行，根据文献［6］常规回流提取法:采用传统热水法提取螺旋藻多糖，螺旋藻5.00 g，提取时间4 h;提取温度60℃;提取固液比1∶15。见表4。

表4 两种提取方法的比较

从表4实验结果可知，超声提取与常规热水萃取的最大差别表现在提取时间和提取率这两方面。超声提取法的多糖提取率高于传统热水提取法的40% 以上，所需时间大大缩短。

4 讨论

将超声技术应用于螺旋藻多糖的提取，能够增加糖类物质的得率。文中探讨了与超声波作用效应相关的超声功率，提取时间，固液比，提取温度4个因素对多糖提取率的影响，同时采用正交实验确立最佳条件。正交优化条件为超声功率320 W，时间50 min，固液比1∶25，温度50℃，在这个最佳条件下多糖提取率是3.295 3%。与传统水提方法比较，超声提取具有迅速、节能、操作简便、提取率高等优点，是一种较好的螺旋藻多糖提取的新工艺。超声技术提取多糖等天然产物将有良好的应用前景。

［1］陈 恋.海洋生物多糖的高值化开发［J］.食品与药品，2007，9(4):68-70.

［2］邓中日，游沛清，王小兵.螺旋藻多糖研究进展［J］.湖南城市学院学报:自然科学版，2005，14(3):63-65.

［3］刘志伟，邵学良.螺旋藻多糖研究进展［J］.中国食物与营养，2007，28(11):18-21.

［4］丰 荚，罗永明，严喜鸾，等.螺旋藻多糖含量测定［J］.时珍国医国药，1999，11(2):88.

［5］杨文杰，黄惠华，李 琳，等.螺旋藻多糖的水提微波辅助提取［J］.食品工业科技，2003，24(8):40-42.

［6］张文雄，单海错，黄文榜，等.螺旋藻粗多糖提取工艺研究［J］.广西化工，1993，28(1):11-14.