人工栽培和野生獐牙菜中齐墩果酸成分分析和比较研究

周 利， 王先飞， 施超欧， 陈桂琛， 史 萍*

(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237;2.华东理工大学分析测试中心，上海 200237;3.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810008)

獐牙菜属龙胆科Gentianaceae，主要分布于海拔2 200～3 600 m青藏高原和云贵高原的山坡灌草丛中或山谷溪边，是用于治疗黄疸性肝胆疾病和病毒性肝炎的珍稀草本植物，俗称“藏茵陈”［1］。近年来，随着我国民族医药的迅速发展，獐牙菜的需求量快速增加，特别是在植物生长阶段的花果期大量采收，导致其资源量锐减和逐渐枯竭，其地域分布亦日益狭窄，野生资源植物濒临灭绝［2］。因此，进行人工引种和栽培獐牙菜具有重要意义。经过几年的努力，本课题组已经成功完成了包括川西獐牙菜Swertia mussotii和抱茎獐牙菜S.franchetiana等野生獐牙菜类植物的人工引种和栽培［3］，也对植物的部分药效成分如当药黄素、龙胆苦苷、芒果苷等作了较系统的研究［4-5］。但对于齐墩果酸在野生和栽培品种的积累状况还没有相关的数据。

齐墩果酸是獐牙菜中富含抗肝炎的最主要药效成分，具有护肝降酶、抗炎、强心利尿、降血糖、抗肿瘤的功效［6-10］，分子式:C30H48O3，分子量:456.71，分子结构式如图1所示。

图1 齐墩果酸分子结构式

是白色针状结晶，属于三萜类，熔点:308～310°C，不溶于水，可溶于乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷。本实验研究野生川西獐牙菜和抱茎獐牙菜及人工引种栽培条件下不同部位齐墩果酸的质量分数和变化，为獐牙菜药材资源的保护和开发、引种以及合理利用提供依据。

1 实验材料、试剂和方法

1.1 实验供试样品材料 野生川西獐牙菜和抱茎獐牙菜药材取自于青海玉树海拔3 500 m左右山地，由中国科学院西北高原生物研究所卢学峰研究员鉴定;人工栽培獐牙菜采于平安县海拔2 500 m引种栽培基地，为两年生草本植物。

1.2 实验仪器和试剂

1.2.1 实验仪器 高效液相色谱仪Agilent 1100 Series(Agilent USA)。包括在线真空脱气系统，四元泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器;离子阱质谱仪LCQ Deca XP Plus(Thermo USA)，ESI负离子检测定性;台式离心机 TGL-16B(上海安亭科学仪器厂);索氏回流提取器(玻璃，自制)。

1.2.2 实验药品和试剂 齐墩果酸对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号:110709-200304，供定量测定用);无水乙醇，分析纯;甲醇，色谱级;乙腈，色谱级;纯水，自制。

1.3 实验方法

1.3.1 样品溶液的制备 齐墩果酸在水中溶解度小，但易溶于醇、丙酮、乙酸乙酯等，本实验参考前人的方法［11-13］，采用75%的乙醇回流提取，具体过程如下:取不同部位根、茎、叶、花和全枝獐牙菜样品于60℃烘箱干燥8 h，然后粉碎，精密称取1 g样品加入75%的乙醇10 mL，索氏回流提取1 h，放冷后滤过，残渣再按此方法重复提取2次，合并提取液，进行旋转蒸发浓缩，用75%的乙醇溶解浓缩的提取物，并定容至5 mL量瓶中，取浓缩液1 mL于15 000 r/min离心10 min，取上清液供分析备用。

1.3.2 液相色谱及质谱条件 液相色谱条件:Hypersil ODS-2 柱 C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水溶液(65 ∶35v/v)，柱温:30 ℃，体积流量:0.8 mL/min，检测波长:210 nm，进样量:10 μL，用外标法定量。质谱条件:ESI负离子/MS/MS检测，离子源喷射电压3.5 kV;毛细管温度300℃;毛细管电压15 V;鞘气和辅助气均为氮气，体积流量分别为60arb和15arb;碰撞气为氦气;检测方式采用1～2级全扫描质谱。

1.3.3 对照品溶液的制备 精密称取一定量的齐墩果酸对照品，用甲醇溶解，制成质量浓度为0.212 0 mg/mL的贮备液，15 000 r/min离心5 min，上清液作为对照品溶液备用。

1.3.4 精密度试验 取齐墩果酸对照品溶液(0.212 0 mg/mL)，连续重复进样5次，计算齐墩果酸的峰面积，获得相对标准差值(RSD)。

1.3.5 重复性试验 精密称取同一批獐牙菜药材5份，依上述方法制备样品溶液，进行重复性的RSD测定。

1.3.6 稳定性试验 取1.3.1 项样品溶液，分别在 0、2、4、8、16 h进样20 μL，测定齐墩果酸的稳定性。

1.3.7 加样回收率试验 取已知质量分数的药材样品5份，分别加入与样品量之比约为1∶1的齐墩果酸对照品，按样品制备方法和测试条件测定峰面积，计算样品回收率。

2 实验结果与讨论

2.1 液相色谱条件的优化 因为齐墩果酸和甲醇有相近的最大紫外吸收波长(λmax)，为了降低流动相对齐墩果酸紫外吸收的干扰，参照李路军等的方法［13］，研究不同的液相色谱条件和洗脱系统，发现在本文的色谱条件下检测，基线平稳，分离效果好。图2为试样品和齐墩果酸对照品的液相色谱和质谱图谱。由图2A和图2B可以看出，齐墩果酸对照品和样品图谱结果一致，样品的分离度好(图2B)。采用负离子全扫描模式，均可见齐墩果酸［M-H］－准分子离子峰455.5及455.5的二级质谱中都有相同的407.5的特征子离子峰(图2C、D)，表明此峰为目标物齐墩果酸单一成分。

图2 试样和齐墩果酸对照品液相色谱和质谱图谱

2.2 齐墩果酸成分的测定

2.2.1 齐墩果酸标准曲线的制备 分别精密量取上述齐墩果酸对照品备用液 2、5、10、15、20 μL 进样，以色谱峰面积(Y)对质量(X)进行回归，齐墩果酸标准曲线的线性回归方程为Y=118.29X，相关系数为0.999 9，说明在 0.424 ～4.24 μg范围内色谱峰面积与齐墩果酸质量之间具有良好的线性关系。

2.2.2 齐墩果酸方法学考察结果 精密度试验的RSD为0.95%，表明仪器精密度良好;重复性试验得到 RSD为1.97%，表明该方法的重复性较好。样品稳定性试验的RSD为2.86%，表明该方法提取获得样品溶液在16 h内稳定;回收率试验表明，目标物齐墩果酸的回收率可达98.60%，RSD为2.22%。因此本实验采用的齐墩果酸测定方法是可靠的。

2.2.3 样品中齐墩果酸的测定 精确取样品溶液20 μL进样测定齐墩果酸峰面积，重复3次。根据3次面积的平均值，从标准曲线计算样品中齐墩果酸质量分数。结果见表1。

对两种野生和人工栽培獐牙菜植物的整株以及花、茎、叶、根不同部位齐墩果酸分析计算结果如表1所示。由表1结果可以看出，无论是野生的还是人工栽培的獐牙菜，整株抱茎獐牙菜中齐墩果酸质量分数均高于川西獐牙菜中齐墩果酸的质量分数，高出30%以上;川西獐牙菜和抱茎獐牙菜两个品种，无论是整株还是花、茎、叶和根不同部位，野生品种和人工栽培品种中齐墩果酸质量分数差异不大。由表1的结果还可以看出，獐牙菜植物不同部位花、叶、茎和根其齐墩果酸质量分数不尽相同，花和叶质量分数最高，植物根中质量分数最低;花和叶中齐墩果酸质量分数高出植物茎的质量分数近5倍、高出植物根的质量分数10倍以上。

表1 獐牙菜不同部位中齐墩果酸

3 结论

液相色谱条件采用乙腈-水溶液(65∶35v/v)流动相，体积流量0.8 mL/min，210 nm检测波长，对照品和样品基线平稳、分离度良好。质谱分析表明为单一目标成分。引种到低海拔的两种獐牙菜，无论是川西獐牙菜还是抱茎獐牙菜，野生和人工栽培植物全株中齐墩果酸的质量分数无显著变化。对野生和人工栽培不同生境条件下生长的獐牙菜，整株抱茎獐牙菜中齐墩果酸量均高于川西獐牙菜中齐墩果酸的质量分数，花、叶、茎和根不同部位齐墩果酸质量分数不尽相同，齐墩果酸主要集中在植物的花和叶中，花和叶中齐墩果酸最高，植物根中齐墩果酸质量分数最低，不到花或叶质量分数的十分之一。结果表明人工栽培的川西獐牙菜和抱茎獐牙菜药材仍具有优良的品质.

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