款冬花多糖几种脱色工艺的研究与对比

高晶晶， 李稳宏， 李婉婷， 蔡 静， 赵 鹏， 延绥宏， 朱骤海

(西北大学化工学院，陕西西安 710069)

款冬花为菊科植物款冬Tussilago farfara的干燥花蕾，又名冬花、九九花等。它是应用历史悠久的中药材，始载于《神农本草经》，被列为中品［1］，临床上主要用于新久咳嗽，喘咳痰多，劳嗽咳血等症［2］。最新研究表明款冬花粗多糖对体外培养人白血病K562细胞有显著的凋亡诱导作用，在治疗白血病方面具有良好前景［3］。而目前对款冬花多糖深入研究报道较少，为此作者在这方面进行了一定的研究。

对款冬花多糖的脱色是其分离纯化工艺中一个重要的环节。目前提取的款冬花多糖颜色一般较深，必须对其中的色素进行脱除。多糖脱色的常用方法有活性炭法、双氧水法以及树脂法等［4］，本实验对这几种常用的方法进行了比较研究，以期得到一条适合款冬花多糖脱色的工艺路线。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂 款冬花由陕西省新药技术开发中心提供;30%H2O2，考马斯亮蓝，十六烷基三甲基溴化铵，异辛烷，正己醇，NaCl，苯酚，硫酸等试剂均为分析纯;西安市蓝深树脂公司提供 LS-21，LS-30，LS-700B，LS-206型大孔吸附树脂;西安市蓝晓树脂公司提供LXD-762，LSA-700B型大孔吸附树脂;722分光光度计，日本岛津公司;ZHWY-200B型恒温震荡器，上海智城分析仪有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备款冬花多糖及脱蛋白 将款冬花干燥花蕾粉碎，加入95%的乙醇脱脂，脱脂后的款冬花加入一定量的水，用超声辅助浸提30 min，抽滤，合并滤液浓缩，然后醇沉，抽滤，滤饼用无水乙醇、乙醚洗涤数次，干燥后即可得到黄棕色的款冬花多糖粗品。

将上述粗多糖配制成一定质量浓度的粗多糖液，加入一定量Sevage试剂(氯仿-正丁醇为4∶1)，经3 000 r/min均质机充分混合后离心，取上清液再加入Sevage试剂按上述方法重复操作多次，直至蛋白脱除率达到80%以上为止。

1.2.2 款冬花多糖脱色方法简介

方法1 双氧水氧化法脱色:取脱蛋白后的多糖配制30 mL质量浓度为2 mg/mL的粗多糖溶液，调节pH为9，加入等体积30%的H2O2，置于45℃恒温水浴中脱色6 h。

方法2 活性炭吸附脱色:活性炭用重蒸水清洗后过滤，在120℃下干燥8 h，冷却备用。取脱蛋白后的多糖配制30 mL质量浓度为2 mg/mL的粗多糖溶液，向其中加入1.5%的活性炭，置于45℃恒温水浴中，脱色2 h。

方法3 反胶束溶液脱色［5］:反胶束溶液的制备方法为准确移取2 mL正己醇、8 mL异辛烷和0.548 g十六烷基三甲基溴化铵混合。多糖预处理液的制备方法为配制质量浓度为4 mg/mL脱蛋白后粗多糖溶液100 mL，然后在沸水浴中加热30 min，取出并冷却至室温，3 000 r/min下离心3 min，取其中40 mL上清液，并向其中加入0.467 g NaCl，搅拌至全部溶解，备用。最后取3 mL的多糖预处理液各向其中加入1 mL反胶束溶液，振荡3 min，静置30 min，取下层液体测其色素、多糖及蛋白量。

方法4 大孔吸附树脂法脱色:按常规的树脂预处理方法对6种树脂进行处理，通过静态吸附实验，初选一个较优的树脂，对其进行脱色实验。

1.3 分析方法

1.3.1 测定多糖中色素量及计算其脱色率 将款冬花粗多糖的水溶液在波长为200 nm～700 nm范围内进行扫描，发现溶液在280 nm～320 nm处有一个吸收平台，因此将色素的检测波长定为320 nm。

A前、A后分别为脱色前后多糖样品的吸光度值。

1.3.2 测定多糖量及计算多糖保留率 采用苯酚-硫酸法［6］测定多糖的量。

M前、M后分别为脱色前后的多糖量。

1.3.3 测定多糖中蛋白量及计算蛋白去除率采用考马斯亮蓝法［7］测定蛋白的量。C前、C后分别为脱色前后的蛋白质质量浓度。

2 结果与讨论

2.1 不同脱色方法的结果和分析 见图1。

图1 不同脱色方法结果比较

由图1可知，双氧水脱色法的脱色率和多糖保留率均处于中等水平。其脱色原理是双氧水在受热过程和光照条件下会迅速分解产生初生态氧，这种氧会破坏多糖中的有色物质，但其缺点是双氧水在脱除色素的同时，它的强氧化性也会使多糖的羟基等活泼基团氧化，使多糖降解，从而降低了多糖的保留率［8］。

活性炭吸附脱色法的脱色率很高，但其缺点是多糖保留率低，是由于活性炭有很强的吸附作用，在吸附色素的同时也会吸附大量的多糖，而且采用这种方法脱色后，过滤起来也相当困难［5］。

反胶束溶液法是一种新型的脱色方法，它的优点在于脱色的过程中不会破坏多糖，仍然可以保留大部分多糖。但是脱色效果相对于其它方法不是很明显，而且在多糖液中加入的反胶束溶液在脱色后很难完全去除干净，这将会对后续的纯化及结构鉴定方面的研究产生一定的影响。

树脂吸附脱色法是一种比较好的脱色方法，尽管其脱色率没有活性炭法高，但多糖保留率高，并且具有较高的蛋白去除率。因此本实验又对树脂脱色法进行了深入的研究。

2.2 大孔吸附树脂法脱色工艺条件优化研究

2.2.1 静态吸附实验优选脱色树脂 将6种树脂用常规树脂处理方法预处理后各称取1 g(干质量)放入具塞锥形瓶中，分别加入100 mL质量浓度为2 mg/mL的粗多糖溶液，室温下置于恒温振荡器中，200 r/min，每隔一定时间取样测其色素量，最后测其多糖保留率和蛋白去除率，结果见图2和图3。

图2 静态吸附动力学曲线

图3 不同树脂静态吸附脱色结果

由图可见，LXD-762和LS-206两种树脂的脱色率均较高，但LXD-762的多糖保留率明显较差。因此，选用LS-206对其脱色性能进行进一步研究。

2.2.2 动态吸附单因素实验

2.2.2.1 上样速度对脱色效果的影响 用湿法将处理好的20 mL树脂(LS-206，下同)装入玻璃交换柱，配制粗多糖液20 mL，浓度为4 mg/mL，上柱，迅速调节其体积流量为1 BV/h，然后用2 BV的蒸馏水冲洗，后测脱色液中色素的量，最后将溶液与洗液合并，测合并液的多糖和蛋白量。然后在相同的条件下对其它上柱速度1.5 BV/h、2 BV/h、2.5 BV/h、3 BV/h进行考察，每一个实验均做两遍，然后取其平均值，结果见图4。

图4 上柱体积流量对树脂脱色的影响

由图4可知，上柱体积流量为1 BV/h时脱色效果较优，而且此时多糖保留率也较好，约为69%。

2.2.2.2 上样量对脱色效果的影响 用湿法装柱，柱体积为20 mL，配制质量浓度为4 mg/mL的粗多糖液，体积分别为 10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL，上柱，迅速调节体积流量为1 BV/h，然后分别用1 BV、2 BV、3 BV、4 BV、5 BV 的蒸馏水冲洗，后测脱色液色素量，最后将溶液与洗液合并，测合并液的多糖和蛋白量，每一个实验均做两遍，然后取其平均值，结果见图5。

图5 上样量对树脂脱色的影响

由图5可知，当上样量为30 mL(即1.5 BV)时的脱色效果较佳，此时的多糖保留率约为71%。

2.2.2.3 上样质量浓度对脱色效果的影响 用湿法装柱，柱体积为20 mL，分别配制质量浓度为2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL的粗多糖液30 mL，上柱，迅速调节体积流量为1 BV/h，然后用3 BV的蒸馏水冲洗，后测脱色液色素量，最后将溶液与洗液合并，测合并液的多糖和蛋白量，每一个实验均做两遍，然后取其平均值，结果见图6。

图6 上样质量浓度对树脂脱色的影响

由图6可知，质量浓度为2 mg/mL时脱色效果较好，但此时多糖保留率仅为33%，当上样质量浓度为6 mg/mL时多糖保留率较高为73%，脱色率也较高为94.21%。因此，选用6 mg/mL为适宜上样质量浓度。此时蛋白去除率为76.50%。

2.2.3 重复验证实验 按照上述最优条件进行了3批验证实验，实验结果如表1所示。由表可知在此工艺条件下实验结果比较稳定，重现性良好。

表1 动态吸附验证实验结果

3 结论

实验结果表明:双氧水法、活性炭法和反胶束溶液法对多糖脱色都有不同程度的损失;树脂法不仅脱色效果最好，而且同时具有多糖保留率高和一定脱除蛋白作用的优点。

采用LS-206树脂吸附脱色的最佳工艺条件为:体积流量1 BV/h，上样量为1.5 BV，上样质量浓度为6 mg/mL。采用此工艺对款冬花多糖提取液脱色率可达94.19%，多糖保留率为73.02%，蛋白质去除率为76.44%。

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