桑枝总黄酮的抗氧化活性研究

章丹丹， 高月红， Jessica Tao Li， 潘一峰， 卞 卡，3*

(1.上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心，上海 201203;2.上海现代中医药技术发展有限公司，上海 200051;3.美国德克萨斯大学休斯顿医学院综合生物及药理学系，德克萨斯大学分子医学研究所，休斯顿TX 77030)

桑枝Mori Ramulus是桑科植物桑Morus albaL.的干燥嫩枝，是中医常用的传统药物，有祛风活络、通利关节、燥湿利水之功效，临床多用于肩臂关节肿痛麻木，风湿痹证等多种疾病［1］。桑枝含有多种黄酮成分，具有抗炎抗氧化、降糖降脂以及提高机体免疫功能等多种药效［2］。桑枝作为保健物品，其皮的醇提物具有较好的2，2-diphenyl-picrylhydrazyl radical(DPPH)自由基清除作用，不同桑枝品种总黄酮的总抗氧化能力、清除自由基能力及清除超氧阴离子能力各有不同，且总抗氧化能力与总黄酮含量呈正相关关系［3］。目前尚无应用多种化学和细胞模型对桑枝精制总黄酮进行综合抗氧化活性研究的报道。

本实验考察了利用有机溶剂及大孔树脂纯化富集的桑枝总黄酮于体外3种抗氧化无细胞系统和2种细胞炎症模型中的抗氧化活性。

1 材料和仪器

1.1 药材和试剂 桑枝购自上海养和堂中药饮片有限公司。D-101树脂，天津南开大学化工厂。芦丁标准品，购自上海中药标准化研究中心。人脐静脉内皮细胞株(ECV304)购自武汉大学中国典型培养物保存中心。小鼠巨噬细胞 RAW264.7购自ATCC公司。RPMI 1640、胎牛血清购自Gibco公司。Trolox、DPPH、2，4，6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ)、2，2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid(ABTS)、肌红蛋白(Mb)、血管紧张素(Ang II)、二甲基亚砜(DMSO)、脂多糖(lipopolysaccharide LPS)、Griess reactin试剂均购自Sigma公司。Bio-rad蛋白测定试剂购自Bio-rad公司。鼠重组IFN-γ购自BD公司。其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器 旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司);酶标仪(美国MD公司);D278532高速冷冻离心机(德国Hettich公司);超低温冰箱(美国 Thermo公司);UV21700紫外分光光度计(日本岛津公司);超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 桑枝总黄酮(TFMR)的制备 桑枝饮片用75%乙醇80℃回流提取3次，合并提取液，过滤后减压回收乙醇。得到的乙醇提取物用石油醚脱脂，直至石油醚层近无色。脱脂提取物加水溶解，离心后取上清液，用乙酸乙酯萃取多次至乙酸乙酯层无色，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至小体积，D-101树脂柱吸附，继而以蒸馏水、10%乙醇预洗脱，70%乙醇洗脱树脂柱，收集70%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩物真空干燥得桑枝总黄酮。

2.2 桑枝总黄酮的测定 准确称取21.5 mg芦丁置于100 mL量瓶中，用95%乙醇溶解，再用30%乙醇定容至刻度。准确吸取此标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 置25 mL 量瓶，分别加30%乙醇至 10 mL，摇匀，加 5%NaNO21.0 mL，摇匀，放置6 min，加10%Al2(NO3)31.0 mL，摇匀，放置6 min，再加1 mol/L NaOH 10 mL，用30%乙醇定容后摇匀，放置15 min，以0管作为空白，于510 nm处测吸收值A，以浓度C对吸光值A回归，A=2.435 1C－0.002 8，R2=0.998 7。将桑枝总黄酮样品稀释一定浓度，精密吸取1 mL于25 mL量瓶，平行3管，分别加30%乙醇至10 mL，以下同标准曲线方法测吸光值A，代入标准曲线方程计算桑枝样品液的总黄酮量为59.28%。

2.3 桑枝总黄酮的直接抗氧化能力测定

2.3.1 Ferric reduction ability power(FRAP)法245 μL新鲜配制的FRAP溶液，加入5 μL样品，静置10 min后，593 nm测定样品和标准对照Trolox对还原Fe3+的能力。FRAP溶液:0.3 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 3.6)、10 mmol/L TPTZ(溶于 40 mmol/L HCl)和20 mmol/L FeCl3以10∶1∶1(v/v)混合。结果用mmol/L Trolox相对值表示。

2.3.2 DPPH 法 245 μL 0.1 mmol/L DPPH 甲醇溶液中加入5 μL样品，室温静止放置30 min，于517 nm处测定样品和标准对照Trolox对DPPH自由基的清除能力，结果用mmol/L Trolox相对值表示。

2.3.3 2，2-azinobis-［3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic］acid(ABTS)法 385 μL PBS(5 mmol/L，pH 7.4)，加入 50 μL Mb(45 μmol/L)和10 μL 样品，再加55 μL ABTS(1.8 mmol/L)，精确3 min 后，在734 nm测量样品及标准对照对ABTS的清除能力。结果用mmol/L Trolox相对值表示。

2.4 桑枝总黄酮干预细胞炎症模型

2.4.1 Griess法考察桑枝总黄酮对巨噬细胞炎症模型亚硝酸盐含量的影响 RAW264.7细胞株培养于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃和CO25%条件下培养。细胞悬液以每孔1×105个细胞接种于96孔板，培养过夜。桑枝总黄酮以0.1 g/L终浓度预孵育6 h。空白组采用含0.1%DMSO的RMPI 1640培养细胞。模型组采用 LPS(100 μg/L)和 IFN-γ(1 ×104U/L)协同刺激细胞。刺激维持24 h后，吸取96孔板中的培养液100 μL，加入等体积的Griess试剂，室温反应10 min，用酶标仪读取540 nm处光吸收值。以亚硝酸盐标准曲线计算桑枝总黄酮干预后细胞上清液中亚硝酸盐的含量及其抑制率。

2.4.2 ABTS和FRAP法考察桑枝总黄酮对内皮细胞炎症模型中抗氧化活性的影响 人脐静脉内皮细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，于5%CO237℃的培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化传代。终浓度0.1 g/L的桑枝总黄酮和人血管内皮细胞(ECV304)预孵育1 h后加入终浓度为 0.02 μmol/L Ang II，作用 24 h 后，收集细胞蛋白，Lowry法测定细胞蛋白质水平后取蛋白上清液，应用ABTS和FRAP法进行抗氧化检测，细胞结果以mmol/L Trolox当量/g蛋白表示。

2.5 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示，差异显著性检验采用t检验。

3 结果

3.1 桑枝总黄酮的直接抗氧化能力 实验结果显示，桑枝总黄酮清除ABTS自由基的能力为0.623个Trolox当量(1 mmol/L Trolox的清除自由基能力)，DPPH自由基的能力为0.245个Trolox当量，而对铁离子的还原能力为0.181个Trolox当量。其中，桑枝总黄酮对ABTS自由基的清除能力＞对DPPH自由基的清除能力＞对铁离子的还原能力(见表1)。

表1 桑枝总黄酮的抗氧化能力(mmol/L Trolox当量，n=3)Tab.1 Antioxidants activities of TFMR(m mol/L Trolox equivalent，n=3)

3.2 桑枝总黄酮干预对LPS协同IFN-γ刺激细胞模型中亚硝酸盐量的影响 桑枝总黄酮干预LPS协同IFN-γ刺激细胞模型后，模型组亚硝酸盐量显著增高，较对照组提高了12.948倍(P＜0.01)，给药组与模型组相比，亚硝酸盐量下降了31.405%(P＜0.05)，抑制率达51.890%(见表2)。

表2 桑枝总黄酮对亚硝酸盐量的影响(n=6)Tab.2 Nitrite accumulation of TFMR by LPS plus IFN-γ stimulated cell inflammatory model(n=6)

3.3 桑枝总黄酮干预Ang II诱导的细胞炎症模型 Ang II刺激细胞后，模型组总抗氧化能力和还原能力均下降(P＜0.05)，桑枝总黄酮干预细胞后，无论采用FRAP法还是ABTS法，细胞蛋白的总抗氧化水平均显著高于模型组(P＜0.05)(见表3)。

4 讨论

自由基生物学研究认为众多疾病如心脑血管疾病、糖尿病、癌症等与过量的自由基如活性氧/活性氮(ROS/RNS)引起的氧化应激，对DNA、蛋白质及生物膜产生损伤密切有关。炎症是以上疾病共有的病理机制，其发生发展过程中存在着氧化应激［4］。Ang II能引起血管壁的炎症反应，用血管紧张素-转换酶抑制剂(ACEIs)和Ang II拮抗剂等对肾素-血管紧张素系统进行阻断，可减少血管炎性细胞。LPS协同IFN-γ是经典的炎症刺激物，对巨噬细胞的诱导炎症模型已广泛应用于炎症性疾病的分子病理机制的研究。

表3 桑枝总黄酮在Ang II模型中的抗氧化能力(mmol/L Trolox当量/g蛋白，n=3)Tab.3 Antioxidant capacity of TFMR by AngII stimulated cell inflammatory model(mol/L Trolox/g protein，n=3)

自由基的清除是抗氧化剂发挥抗氧化作用的主要机制［5］。ABTS法和DPPH法都是检测样品对自由基的清除能力，当ABTS由过硫酸铵氧化产生ABTS·+自由基，它与ferryl-肌红蛋白在734 nm处形成相对稳定的蓝绿色发色基团，当有抗氧化剂和氢供体存在时，抑制发色基团形成，抑制程度取决于样品的抗氧化活性和浓度［6］。DPPH法利用了抗氧化剂清除DPPH·时与其孤对电子配对而使其在517 nm处的吸光值降低的原理［7］。而FRAP法基于氧化还原反应的比色法，在酸性条件下三价铁被抗氧化剂还原成二价铁在593 nm处有强吸收，从而检测抗氧化剂的还原能力［8］。Griess法是利用检测试剂与自由基一氧化氮的稳定产物亚硝酸盐形成的紫红色物质在540 nm处有强吸收来检测样本对亚硝酸盐的清除能力［9］。Trolox是一种类似于VE的水溶性物质，常常作为自由基反应的参比物，评价被测样品的总抗氧化能力及被测样品间的横向比较。

本实验采用了细胞学实验和体外化学实验相结合的方法综合评价桑枝总黄酮的抗氧化活性。桑枝总黄酮显示较强的自由基清除能力，且对ABTS自由基的清除能力优于DPPH自由基的清除能力，具有良好的还原能力。在细胞炎症模型中对ABTS自由基的清除能力优于对铁离子的还原能力，并能清除亚硝酸盐。对桑枝总黄酮的抗氧化能力检测提示其作用机制侧重于清除自由基能力。

桑枝总黄酮作为天然抗氧化剂提高细胞清除自由基能力，在抗氧化、对抗衰老及防癌方面具有一定的作用，作为抗氧化药物具有进一步开发的价值。

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