骆驼蓬总碱提取纯化工艺及其对铝致痴呆小鼠作用的研究

付计瑞， 滕 亮*， 戴秀勇， 于富生

(1.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830054;2.新疆华圣元医药科技有限公司，新疆乌鲁木齐 830011)

骆驼蓬为骆驼蓬属Peganum蒺藜科Zygophyllaceae多年生草本植物，全世界共6种，我国有3种。骆驼蓬属植物在我国作为民间药或民族药使用已有很长的历史，资源丰富蕴藏量大［1－3］。根据《卫生部药品标准维吾尔药分册》记载［4］:骆驼蓬子具有坚固筋脉，助阳暖阴，清除黏稠体液，消散寒湿之气的功能，用于偏瘫健忘，神昏头痛等症状。国外则早在19世纪就有将骆驼蓬子生物碱用于治疗帕金森病和老年性痴呆症的临床报道［5］。骆驼蓬全草含有生物碱、甾体、黄酮、蒽醌、氨基酸等成分［6］。其中生物碱种类最多，其量在植株中分布依次为种子＞根＞种壳＞茎＞叶。国内目前研究较为集中的方向为骆驼蓬总碱及骆驼蓬生物碱单体抗肿瘤方面，但对于其生物碱的中枢作用多认为是毒副作用。基于逆向思维法，同时结合老年痴呆病机的最新学说与骆驼蓬碱作用于中枢的机理描述，课题组认为骆驼蓬的中枢毒副作用很有可能用于老年痴呆的干预与治疗。前期预实验表明骆驼蓬总碱的中枢神经系统毒性作用具有明确的剂量依赖性，通过调整给药剂量可减低其中枢毒性。本实验以骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱总含量为工艺优选指标，采用均匀试验设计优选新疆骆驼蓬种子中骆驼蓬总碱的提取工艺与纯化工艺，并评价了骆驼蓬总碱提取物对三氯化铝造成的老年痴呆小鼠的预防和治疗作用，以及为该药材的后续开发奠定一定的试验基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 高效液相色谱仪(Laballiance PC－2005系统);分析天平(FA1004 HENGPING);天孚牌系列电子天平(常熟市金羊砝码仪器有限公司);MGB型迷宫刺激器(张家港市三兴教学机械厂);LS3120超声仪(BENCHTOP CLEANERS);CLDZX－40SC型立式自控电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);注射器(上海宝岛医用器材有限公司批号:20090817);KMD型调温电热套(山东省邺城永兴仪器厂);旋转蒸发器 RE－52A(上海亚荣生化仪器厂);SH2－D循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂);D2H－200型真空干燥箱(上海圣欣科学仪器有限公司)。

1.2 试剂 骆驼蓬种子、去氢骆驼蓬碱由新疆华圣元医药科技有限公司提供，经于富生副主任药师鉴定。去氢骆驼蓬碱对照品(百灵威化学技术有限公司，批号:302972500，纯度:98%);骆驼蓬碱对照品(Fluka，批号:2061526，纯度:98%);无水 AlCl3(上海山浦化工有限公司，批号:20040517);生理盐水(新疆华世丹药业股份有限公司，批号:10030615);石杉碱甲片(河南太龙药业股份有限公司，批号:091102);盐酸(西安化学试剂厂，批号:0908103);乙醇(安徽安特生物化学有限公司出品，批号:0708093601);色谱甲醇(Tedia，批号:904902);二乙胺(天津市光复精细化工研究所，批号:2006819);硫酸铵(北京化学试剂厂，批号:801003);甲醇(西安化学试剂厂，批号:0908101)。

1.3 实验动物 昆明种小鼠，购于新疆疾病控制中心，许可证号:SCXK(新)2003－002，3 月龄(30 ～35 g)，雌雄各半，共350只。

2 方法与结果

2.1 骆驼蓬总碱提取纯化工艺的研究

2.1.1 优选指标 以提取物中骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的量之和为优选指标来确定提取工艺。

2.1.1.1 样品中骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的含量测定 色谱条件为:流动相:甲醇－0.01 mol/L硫酸铵溶液－二乙胺(70∶30∶0.4);柱温:30℃;体积流量:0.5 mL/min;检测波长:320 nm(去氢骆驼蓬碱);372 nm(骆驼蓬碱);进样量:10 μL。

对照品溶液的制备:精密称取骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱各10 mg，置于25 mL量瓶中，用0.1 mol/L盐酸，超声溶解，并加盐酸至刻度，精密吸取1 mL，置于10 mL量瓶中，加盐酸至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备:精密称取干浸膏20 mg(骆驼蓬总碱纯化物10 mg)，置于25 mL量瓶中，用0.1 mol/L盐酸，超声溶解，并加至刻度，精密吸取1 mL，置于10 mL量瓶中，加盐酸至刻度，摇匀，即得。

目前律师调解存在的问题很大程度在于各方利益诉求的不一致，这需要建立正向引导和激励机制，平衡各方利益，实现多方共赢。

2.1.1.2 骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱含量测定的方法学考察 方法学考察表明骆驼蓬碱在0.004 35～0.278 4 mg/mL之间的质量浓度与峰面积呈线性关系(r=0.999 5)，重复性试验 RSD 为1.5%，精密度试验RSD为0.50%，稳定性考察表明样品中骆驼蓬碱在24 h内稳定，方法平均加样回收率RSD为0.80%。

去氢骆驼蓬碱在0.003 15～0.201 6 mg/mL之间的质量浓度与峰面积呈线性关系(r=0.999 5)，重复性试验RSD为1.3%，精密度试验RSD为1.38%，稳定性考察表明样品中骆驼蓬碱在24 h内稳定，方法平均加样回收率RSD为1.1%。去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱对照品与供试品色谱图见图1～4。

图1 去氢骆驼蓬碱对照品色谱图

图2 供试品色谱图

2.1.2 骆驼蓬总碱粗提物提取工艺的研究

2.1.2.1 均匀试验设计优选骆驼蓬总碱粗提物的提取工艺 预试验与文献调研表明影响骆驼蓬碱提

图3 骆驼蓬碱对照品色谱图

取效果的主要因素有提取时间、乙醇浓度、乙醇用量，而提取次数、浸泡时间的影响不显著，因此选用U7(73)均匀设计表安排试验，因素水平见表1。称取骆驼蓬种子(20目筛)粉末50 g，按表2进行试验，采用乙醇回流法提取浸膏，并测定干浸膏中骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱，结果见表2。

表1 均匀试验因素水平

表2 U7(73)均匀试验结果

将试验结果采用均匀设计回归分析及优化系统(UROS)进行处理，得回归方程:Y=1.047 8+0.051 8X1－0.004 2X2+0.062 7X3，方程显著性检验:F=183.675，标准差 S=0.030 8，复相关系数 R2=0.997 3，方程显著(P＜0.05)。

2.1.2.2 验证试验 称取骆驼蓬种子(20目筛)粉末50 g 3份，加30%的乙醇4倍量，提取7 h。干燥得干浸膏。测定含量，结果见表3。

表3 骆驼蓬总碱提取工艺验证试验

3 份提取实验的平均值为(1.881 ±0.023)g，RSD为1.2%，说明优选出的提取工艺稳定、合理、可行。

2.1.3 骆驼蓬总碱纯化工艺的研究

2.1.3.1 均匀试验设计优选骆驼蓬总碱的纯化工艺 采用酸溶碱沉法对骆驼蓬总碱粗提物进行纯化。

预试验与文献调研表明影响酸溶碱沉效果的主要因素有加酸量、酸浓度、氨水调pH、超声时间，因此选用U7(74)均匀设计表安排试验，因素水平见表4。称取骆驼蓬总碱干浸膏5 g，按表5进行试验，并测定纯化物中骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱，结果见表5。

表4 因素水平

表5 U7(74)均匀实验安排及结果

将试验结果采用均匀设计回归分析及优化系统(UROS)进行处理，得回归方程:Y=8.871 7－0.065 9X2－1.789 4X3－ 0.000 2X21+0.094 3X23－0.000 1X24，F=999 999.99，标准差 S=0.000 3，复相关系数 R2=1.000 0，方程显著(P＜0.05)。

优化条件为:X1加酸量(倍)为4.15;X2酸浓度(%)为0.603%;X3氨水调pH为9;X4超声时间(min)为10;理论最大值为:0.421 g，预测区间为0.420 2 ～0.422 5 g。

2.1.3.2 验证试验 称取骆驼蓬总碱浸膏5 g 3份，加0.5%的盐酸4倍量超声10 min溶解，氨水调pH为9，放置24 h。过滤，干燥。得骆驼蓬总碱，测定结果见表6。

表6 骆驼蓬总碱纯化工艺验证试验

3份提取实验总碱量的平均值为(0.444 6±0.002)g，RSD 为0.4%，说明优选出的提取工艺稳定、合理、可行。

2.2 骆驼蓬总碱对铝致老年痴呆小鼠的作用

2.2.1 动物分组和给药 将350只昆明种小鼠(雌雄各半，体质量30～35 g)，随机分为5组，分别为空白对照组(生理盐水)、铝致痴呆小鼠模型组(100 mg/kg 三氯化铝)［7－8］、石杉碱甲片阳性对照组(50 mg/kg石杉碱甲片+100 mg/kg三氯化铝)、去氢骆驼蓬碱组(33 mg/kg去氢骆驼蓬碱+100 mg/kg三氯化铝)、骆驼蓬总碱组(33 mg/kg骆驼蓬总碱+100 mg/kg三氯化铝)。先进行三氯化铝腹腔注射，隔日一次，连续注射50 d，以复制慢性铝中毒AD模型。第5天开始除模型组外其他各组灌胃给药，每天1次。

2.2.2 小鼠行为学测试结果 小鼠在第49天进行学习，第50天进行测试，观察小鼠走出迷宫的的正确次数。Y型迷宫:该装置一般分成3等分，分别称之为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂。分别设置为安全区，电击区，起步区。训练时将小鼠获得遭遇电击直接逃避至安全区视为正确反应，反之为错误反应，固定训练次数12次，24 h后测试记忆成绩。结果进行统计学处理，见表7。

3 讨论

3.1 骆驼蓬种子中含有多种生物碱，其中β－咔波啉类生物碱量居多。目前研究比较系统的β－咔波啉类生物碱为骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱。文献调研［9］表明骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱对大脑皮层及运动中枢、脊髓和脑桥等有兴奋作用，同时也是脑中单胺氧化酶抑制剂和5－羟色胺受体的抑制剂。结合老年痴呆病机的最新学说，课题组认为骆驼蓬种子中骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱应为该药材抗老年痴呆的主要物质基础，因此以骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱为提取与纯化的目标对象。通过提取纯化工艺研究可以实现纯化物中骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的总质量分数超过50%。

表7 盐酸去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬总碱对铝致痴呆小鼠的保护作用

3.2 老年痴呆小鼠模型试验结果表明:(1)模型组与空白对照组的正确次数存在显著差异(P＜0.05)，说明模型复制成功;(2)阳性对照组、盐酸去氢骆驼蓬碱组与空白对照组的正确次数存在显著差异(P＜0.05)，同时与模型组的正确次数也存在显著差异(P＜0.05)，说明石杉碱甲与盐酸去氢骆驼蓬碱对于铝致痴呆小鼠的记忆力有一定的保护作用，但保护结果与正常小鼠记忆力仍有区别;(3)骆驼蓬总碱组与空白对照组的正确次数未出现统计学差异(P＞0.05)，说明骆驼蓬总碱对于铝致痴呆小鼠的记忆力有较好保护作用;(4)从动物存活率也可以看出骆驼蓬总碱在对小鼠的生存保护方面有更为理想的效果。

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