不同固定液对大鼠脾石蜡切片HE染色标本的影响

孙海梅 尚宏伟 张立新 季凤清 周德山*

①首都医科大学组胚教研室 北京 100069

脾脏是哺乳动物体内最大的淋巴器官，富含血管和血窦等。虽为实质性器官，但制作脾石蜡切片难度较大，每一个操作步骤均可影响最终的标本质量。其中固定液的选择尤为重要，直接影响最终的标本染色效果[1-2]。

1 材料与方法

1.1 仪器设备和主要试剂[3]

LEICA ASP 300自动脱水机。LEICA EG 1160自动包埋。LEICA RM 2235轮转式石蜡切片机。LEICA AUTO STAINER XL自动染色机。LEICA Q550IW图像分析系统。主要试剂有中性福尔马林固定液；Bouin固定液；Helly固定液；Ehrlich苏木精；1%伊红水溶液。

1.2 实验动物

选用健康成年SD大鼠1只，雌雄不拘。

2 实验方法

2.1 取材和固定

大鼠经乙醚麻醉，剪断颈总动脉放血处死，以减少脾内多余的血液成分。为保持脾结构的完整性，取材时应格外小心，尽量减少金属器械触碰脾实质，用镊子夹持脾周围的结缔组织，小心剥离剔除脾周围多余组织，切取一块近似等边三角形组织块，厚度为5～7 mm，迅速投入固定液中。选择合适的固定液是制作良好脾标本的关键。对此尝试以下常规固定液[3]：中性福尔马林固定液，固定时间为24 h。Bouin固定液，固定时间为24 h。Helly固定液，固定12 h。

2.2 固定后处理

根据不同固定液的要求，采取不同的固定后处理。中性福尔马林固定后流水冲洗12 h，蒸馏水洗。Bouin固定的组织直接使用70%乙醇，去除固定液中苦味酸的黄色。Helly固定的组织流水冲洗12 h，除去固定液中重铬酸钾后蒸馏水洗。

2.3 脱水和透明

用LEICA ASP 300自动脱水机将所有的固定后的组织常规脱水、透明。注意严格控制无水乙醇、二甲苯和浸蜡时间，防止组织变硬变脆影响切片效果。具体步骤：用70%乙醇、80%乙醇、 90%乙醇、95%乙醇脱水各3 h，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ脱水各2 h，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各20 min，石蜡Ⅰ，石蜡Ⅱ浸蜡各40 min。

2.4 包埋和切片

用LEICA EG 1160自动包埋机进行石蜡包埋。脾脏是细胞密集的结构，切片过厚将影响观察效果。用LEICA RM 2235轮转式石蜡切片机切片，厚度为4µm，切片用烤箱50oC烘干。

2.5 HE染色和封片

用LEICA AUTO STAINER XL自动染色机进行HE染色。不同的固定液处理的组织切片在HE染色中，苏木精和伊红的染色及分色时间有所不同，染色中通过随时镜检，优化每一种固定液处理的组织切片的最佳的染色时间，获得每种固定液处理的组织切片最佳染色标本。具体步骤如下。

⑴中性福尔马林固定的组织切片：Ehrlich苏木精染色15 min；盐酸酒精溶液分色35 s；伊红染色10 min；90%乙醇分色40 s。

⑵Bouin固定的组织切片：Ehrlich苏木精染色20 min；盐酸酒精溶液分色35 s；伊红染色13 min；90%乙醇分色40 s。

⑶Helly固定的组织切片：Ehrlich苏木精染色15 min；盐酸酒精溶液分色35 s；伊红染色10 min；90%乙醇分色40 s。

封片使用中性树胶封固。

3 结果

用LEICA Q550IW图像分析系统对3种不同的固定液处理的大鼠脾组织石蜡切片染色结果进行显微镜下观察（染色结果见图1、2、3），并从以下方面进行比较[4-5]，见表1。

图1 大鼠脾石蜡切片HE染色标本中性福尔马林固定×100

图2 大鼠脾石蜡切片HE染色标本Bouin固定液固定×100

图3 大鼠脾石蜡切片HE染色标本Helly固定液固定×100

表1 不同固定液对大鼠脾石蜡切片HE染色结果的比较

4 讨论

组织固定的作用在于使蛋白变性、凝固、沉淀,保持细胞、组织原有的形态[6]。固定是制作脾石蜡切片标本的关键环节，固定液中的化学成分的渗透力，PH值，渗透压，固定时间等诸多因素影响固定液的固定效果[7]。所以选择最佳的固定液将会直接影响标本的质量和染色结果。经三种不同的固定液处理的大鼠脾石蜡切片HE染色标本的染色效果各有不同，各有其优缺点：中性福尔马林固定液：是实验室常规试剂[8]，配制简单易行。但由于固定液中化学成分的渗透压等原因造成结构破损，使切片出现明显的皲裂现象[9]；Bouin固定液：亦为实验室常规固定液，配制简单易行，此固定液是由甲醛、苦味酸和醋酸按一定比例混合而成, 苦味酸和醋酸配合使用能很好的保存组织结构，因此固定的标本组织结构完整。但染色不及其它两种固定方法染色理想，细胞核与细胞质对比强度不明显[10]；Helly固定液：此固定液主要成分是氯化汞和重铬酸钾，甲醛等，氯化汞使组织硬化快，对细胞核和胞质固定良好，并促进染色，重铬酸钾常用于混合固定液中，有助于组织染色[2]。所以经此固定液固定的组织结构完整，清晰，染色鲜艳，细胞核与细胞质染色对比度好，为制作脾石蜡切片标本理想的固定液。但此固定液配制较复杂,且固定后需去除组织内的重铬酸钾和“汞色素”，步骤较复杂。且此固定液中氯化汞属于剧毒药品，管理要严格，废液需要妥善处理，避免环境污染。

5 结语

获得理想的脾石蜡切片HE染色切片的方法：大鼠经乙醚麻醉、颈总动脉放血，标本经Helly固定液固定，常规脱水、透明、包埋，石蜡切片4µm，HE染色Ehrlich苏木精染色15 min；盐酸酒精溶液分色35 s；伊红染色10 min；90%乙醇分色40 s，可获得较理想的脾石蜡切片HE染色标本。

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