家兔肠系膜上动脉闭塞性休克前后的血清比较蛋白质组学初步研究*

李宏杰，要瑞丽，武慧丽，李常颖，王世鑫

(1.华北煤炭医学院基础部病理生理教研室，唐山 063000;2.唐山市职业技术学院基础部，唐山 063004;3.武警医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室，天津 300162)

休克是各种强烈致病因子作用于机体引起的急性循环衰竭，其特点是微循环障碍、重要脏器的灌流障碍及细胞与器官功能代谢障碍，由此引起的全身性危重的病理过程，是引起器官衰竭和死亡的主要原因之一。目前，国内外对休克的研究多采生物化学和分子生物学方法，实验设计采用提出假设-验证假设的模式，对休克机制的研究着眼于某一方面，有一定的局限性，而休克作为一个复杂的病理过程，难以用任何单一机制来解释。

蛋白质组的定义为“一种细胞、组织或完整的生物体所拥有的全套蛋白质”[1]，因此，蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组学(proteomics)是以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化蛋白质的组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律的一门新兴学科。蛋白质组学能在不预设指标情况下，对参与生理和疾病过程的所有蛋白质进行分析。本文通过建立家兔肠系膜上动脉闭塞性(superior mesenteric artery occlusion，SMAO)休克模型，采用了血清比较蛋白质组学研究方法，观察SMAO休克前后血清蛋白质组学变化，为SMAO休克的研究提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要仪器

固相pH 梯度胶条(IPG strip pH 4～7)，尿素、硫脲、CHAPS、二硫苏糖醇(DTT)、两性电解质(Biolyte3-10)、碘乙酰胺(IAA)、三丁基磷(TBP)、TEMED、过硫酸氨、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、SDS、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、蛋白定量试剂盒(RC DC protein assay kits)及去除血清高丰度蛋白试剂盒(Aurum serum protein mini kits)均为Bio-Rad公司产品;甘油、溴酚蓝、低熔点琼脂糖购自Sigma公司，硝酸银、碳酸钠、醋酸钠、无水硫代硫酸钠购自上海BBI公司;丙酮、甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、盐酸为国产分析纯。等电聚焦仪(Protein IEF cell)、垂直电泳系统(ProteinⅡxi Cell)、CHemiDOC XRS凝胶成像系统、PDQuest 7.42 D凝胶图像分析软件均购自Bio-Rad公司。

1.2 家兔SMAO休克模型的复制及血清标本制备

健康家兔10只，体重为(2.5±0.2)kg，雌雄各半。实验前禁食12 h，20%乌拉坦(1 g/kg bw)耳缘静脉麻醉，分离颈外静脉并插管用以取血，分离颈总动脉并插管，连压力换能器，接BL-420生理记录仪(成都泰盟)用以测量平均动脉血压(mean arterial pressure，MAP)。行腹部手术分离肠系膜上动脉，采用夹闭肠系膜上动脉2 h，松夹再灌2 h的方法[2]复制SMAO休克模型，以再灌后MAP低于夹闭前三分之一作为模型成功的判断标准。经颈外静脉于缺血前和再灌2 h后各取血5 ml。将血液室温下静置2 h ，3500r/min 离心 5 min，取上清液 100μl 分装 ，-20℃冻存，用于双向电泳。

1.3 双向电泳样品制备[3]

按Aurum serum protein mini kits(Bio-Rad，美国)说明去除血清高丰度蛋白，每组50μl混合血清最终得到400μl含低丰度蛋白的洗脱液。将洗脱液与-20℃预冷的丙酮按体积比1∶3混合，-20℃孵育过夜，15000×g，4℃离心5 min，沉淀用冷丙酮洗两次，室温晾干。加入水化上样液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲 ，4%CHAPS，65 mmol/L DTT ，0.2%Biolyte3-10)300μl使沉淀中的蛋白充分溶解 ，15000×g、4 ℃离心5 min，取上清液按 RC DC protein assay kits(Bio-Rad，美国)操作手册进行蛋白定量，以确定上样量。取蛋白样品 400μg 用水化上样液补足体积至 330μl，上样前临时加痕量溴酚蓝及TBP 8μl，室温孵育40min，再加浓度为 15 mmol/L 的 IAA 溶液 12μl，室温孵育40min进行还原烷基化。

1.4 双向电泳

双向电泳按Bio-Rad双向电泳操作手册及我们优化好的方案[3]进行:第一向等电聚焦，采用17 cm，pH 4～7线性IPG strip。等电聚焦程序:被动水化12 h;除盐 150V 3 h ，250V l h ，500V l h ，2000V l h，5000V l h;升压10000V 3 h;聚焦达到60000Vh;500V维持l h。等电聚焦后，将胶条从电泳槽中取出，用润湿的滤纸吸掉胶条上多余的矿物油。分别在平衡液Ⅰ〔0.375 mol/LTris-HCL(pH 8.8)，6 mol/L尿素，20%甘油，2%SDS，20g/L DTT〕和平衡液Ⅱ〔0.375mol/LTris-HCL(pH 8.8)，6 mol/L尿素，20%甘油，2%SDS，25 g/L IAA〕中各平衡15 min。将平衡后的IPG胶条置于12%的均匀SDS聚丙烯酰胺凝胶上方，0.5%低溶点琼脂糖封闭。电泳参数为:12 mA/gel 0.5 h，30mA/gel 4.5 h直至溴酚蓝前沿抵达距胶底边缘约0.5 cm时为止。

1.5 染色

凝胶采用与质谱兼容的硝酸银染色方法[4]。电泳后将凝胶浸泡在固定液(25 ml乙酸，100ml乙醇，125 ml超纯水)中60min，将凝胶浸泡在敏化液(75 ml乙醇，0.8 g无水硫代硫酸钠，17 g醋酸钠，165 ml超纯水)中 30min，超纯水洗3次，每次 5 min，将凝胶在硝酸银溶液(0.625 g硝酸银，超纯水加至250ml)中放置20min，超纯水洗2次，每次1 min，接着在显色液(6.25 g碳酸钠，100μl甲醛 ，超纯水加至250ml)中放置2～10min，将凝胶放在终止液(5%乙酸)中终止反应，用超纯水洗3次，每次5 min。

1.6 图像分析

上述样品制备方法所获得的蛋白样品，在相同条件、相同参数设置下分别进行双向电泳，每个样品重复3次，凝胶用CHemiDOC XRS凝胶成像系统成像后，PDQuest 8.02D凝胶图像分析软件进行强度校正、点检测、数目统计、凝胶匹配等处理。组间比较采用定性分析模式，即所选取的差异点只出现在某一组的凝胶上(匹配点相对含量的比值大于10者认为存在差异)。

1.7 MALDI-TOF-TOF-MS鉴定

将凝胶上最明显的4个差异蛋白点分别进行切割、脱色及胰酶胶内酶解，酶解后的混合物用0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)+50%乙睛(ACN)提取肽段 2 次 ，每次 10min，35μl;氮气吹干，溶于10μl 0.1%TFA水溶液中。使用芥子酸(SA)作为基质，基质与样本以 1∶1体积混合 ，取 0.5-1μl加到不锈钢样品靶上，在空气中放置几分钟，待溶剂挥发干后将样品靶送入ABI 4700质谱仪。质谱仪条件为紫外激光波长355 nm，循环率200Hz，加速电压20kV，质量分辨率1500Da，质量范围700到4000m/z，以基质峰和胰酶自动降解离子峰作为内标校正质谱峰。

1.8 蛋白质序列数据库检索

所获得图谱使用ABI公司的GPS软件检索，以MASCOT为搜索引擎，在NCBInr数据库中进行搜索，鉴定蛋白质。查询条件:肽质量指纹图中的肽片段质量控制在700～4000，肽片段分子量最大容许误差控制在±0.1 Da。酶解片段不完全选择为1个，离子选择[M+H]和AVERAGE。最少匹配肽片段数规定为5，mass tolerance 0.2 Da，MS/MS tolerance 0.6 Da，对于一级质谱中相对丰度较高的前5个肽段进行二级质谱鉴定其氨基酸序列。

2 结果

2.1 双向电泳图谱及分析

2-DE图谱蛋白点清晰，分辨率高，重复性好，组内匹配率达到80%以上。用PDQuest 8.02D凝胶图像分析软件检测到蛋白点数目分别为MODS前345±11个，MODS后363±8个。对2组胶图进行数字图像分析并结合肉眼比对，发现8个蛋白质点明显见于MODS前的血清2-DE图中，而MODS后血清2-DE图中未见(图1A)，差异点标号为1-8;而11个蛋白质点明显只见于MODS后血清2-DE图中，而在MODS前血清2-DE图中未见(图1B)，差异点标号为9-19。

Fig.1 2-DE map of serum proteomics in rabbit

2.2 差异蛋白点的串联质谱分析结果及MASCOT数据库搜索

选取差异最明显的第2、9、10、18四个差异蛋白点经质谱分析获得4个蛋白点的肽质量指纹图谱，采用Mascot检索引擎在NCBInr数据库中检索，鉴定差异蛋白的氨基酸序列，仅接受匹配片段数＞5且Mascot分值＞81(P＜0.05)的结果。其中第9和第10蛋白点被鉴定为对氧磷酶和触珠蛋白，均在SMAO休克后血清中含量增高;第2和第18蛋白点在蛋白数据库中没有检索到与之相匹配的蛋白，可能是新蛋白，有待于进一步研究。鉴定后的数据库序列号(Accession Number)、Mascot分值(Mascot Score)、等电点(isoelectric point，PI)、分子量(molecularweight，MW)、匹配肽段数(Peptidesmatched)、蛋白名称(Protein Name)(表1)。

Tab.1 Differential expressed proteins identified by MAILD-TOF-TOF-MS

3 讨论

SMAO休克是肠系膜上动脉闭塞引起肠道缺血、恢复血液再灌注后导致的严重病理过程[5]。肠缺血/再灌注(ischemia/ruperfusion，I/R)可引起肠道屏障功能障碍，导致肠内细菌毒素移位，诱发全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，甚至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，导致危重患者死亡。肠系膜上动脉夹闭法复制的SMAO休克动物模型是经典的休克动物模型，可以较好地模拟休克晚期机体的功能代谢变化。

本研究发现，家兔SMAO休克前后的血清蛋白质组发生明显变化，有8个蛋白质点只见于MODS前的血清2-DE图中，11个蛋白质点只见于MODS后血清2-DE图中。在MODS后的血清差异点中，鉴定出符合条件的2个差异蛋白点，为对氧磷酶和触珠蛋白，均在SMAO休克后血清中含量增高。

对氧磷酶(paraoxonase，PON)是一类能催化水解磷酸酯键的芳香酯酶，主要由肝脏分泌，在血清中主要与高密度脂蛋白结合。PON可降解有机磷酸酯、芳香羧酸酯及氨基甲酸酯等，对有机磷中毒患者有保护作用;PON还可减少过量过氧化物、氧化型磷脂的生成，具有降低动脉粥样硬化发生率、减少和减轻心脑血管疾病发生的作用[6];此外PON还具有抗炎活性[7]。因此在本研究中家兔在SMAO休克后血清中PON含量增高，可能通过它的抗氧化及抗炎活性，发挥一定的保护作用。

触珠蛋白(haptoglobin，Hp)又叫结合珠蛋白，是血清α 2球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白，主要由肝脏合成，也可在脂肪细胞、皮肤、脾、肌肉、肺内等合成，广泛分布于人及其他哺乳动物体液中。结合珠蛋白作为一种急性期蛋白，在参与宿主抗感染、损伤组织的修复以及内环境稳定的过程中起着重要作用，其血清含量在感染、创伤、炎症、心肌梗死等病理状态时显著升高[8]。在本研究中家兔在SMAO休克后血清Hp含量增高，可能是由于急性期反应促进肝脏合成Hp，通过它的抗氧化，抗菌，抑制血管扩张，调节机体免疫平衡的功能可减轻机体的炎症反应，对发生了SMAO休克的机体起到代偿性保护作用。

本研究由于采用了硝酸银染色法，而银染显色的蛋白质点经酶解处理后所含的盐分及其他非蛋白质成分过高，质谱分析时信噪比低，从而降低肽指纹图谱分析的灵敏度，影响分析结果，再加上部分蛋白点丰度较低，本实验中，送检的差异蛋白鉴定成功率仅为50%。我们将在今后的研究中进一步优化实验条件，如加大上样量、使用鉴定率较高的考染等，发现和鉴定出更多的与SMAO休克机制相关的差异蛋白。

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