吸入一氧化碳对肢体严重缺血/再灌注损伤及其所致休克的影响*

赵 津，史中立Δ，齐万争，朱振龙

(1.河北医科大学解剖学教研室，2.附属第一医院病理科，石家庄 050017)

在地震、塌方造成的损伤中，肢体挤压伤占有较高的比例。解除挤压、恢复肢体供血是现场救治的首要步骤。然而，恢复供血所引发的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤，常导致保肢治疗失败甚至危及伤者生命。因此，防治肢体I/R损伤是整体救治的重要环节。我们前期的研究证实，吸入适量一氧化碳(carbon monoxide，CO)可显著减轻肢体I/R损伤及其引发的肝脏损伤，但所用动物模型的肢体缺血时间为4h，缺血程度相对较轻[1，2]。肢体严重缺血者，再灌注后常伴有血压下降甚至出现休克的表现，CO兼有舒张血管的效应，吸入CO对肢体严重I/R损伤有何影响尚缺乏研究。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

全自动生化分析仪LX-20(Beckman Coulter)，无创血压测量分析系统(成都仪器厂)，CO检测仪(FM2-MYJ型，北京中西器材公司)，OLYMPUS显微镜，UFX-DX显微照相系统(Nikon)。含CO的医用空气(CO的体积分数为0.075%，北京海温气体制造厂，气瓶编号 15564、03129、247114)，血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(北京中生生物工程高技术公司)。SD大鼠(清洁级)，由河北省实验动物中心提供(动物许可证号:冀504085)。

1.2 实验分组、肢体I/R动物模型复制及吸入CO的方法

雄性SD大鼠36只，体重220～250g，经实验室饲养7 d，待动物适应实验室环境后，将动物随机分为肢体 I/R12 h、10d组(n=8)、I/R12 h、10d吸入CO(RC)组(n=8)、假手术(S)组(n=4)。I/R 和RC12 h组，于再灌注12 h时取材，用于血清LDH、CK、肢体湿干重量比(wet/dry，W/D)和病理学指标的观测，I/R和RC10d组用于尾动脉压(caudal artery pressure，CAP)和 10d存活率的观测。S组，于假手术后12 h时取材，和I/R、RC12 h组对照实验。

I/R、RC组大鼠在6%水合氯醛(0.3 g/kg ip)全麻状态下，剪毛消毒，切开皮肤，在双侧后肢根部分离暴露股动脉，无创血管夹将其夹闭，缝合创口，用橡皮筋绑扎后肢根部，使后肢缺血8 h，去除血管夹及橡皮筋行再灌注，以此复制肢体严重I/R损伤模型。S组大鼠于全麻下切开皮肤，分离暴露双侧股动脉，模拟手术过程，但不造成肢体缺血。

用于吸气的装置是一个特制的玻璃器皿，设有导入、导出气体的开口，导入口与储气钢瓶通连，钢瓶内储有含 CO的医用空气，CO的体积分数为0.075%。RC组于再灌注前2 h时放入吸气器皿内，开始持续吸入含有CO的医用空气，直至再灌注后4h，共计吸入 6 h。S、I/R组暴露于空气中，自主呼吸。

1.3 大鼠CAP及10d存活率观测

按照无创尾动脉血压测量分析系统的测定要求，每次测血压前将大鼠在37°C环境中保温15～20min，以使尾动脉扩张，将加压套套在大鼠尾近心端处，脉搏换能器置于尾中上1/3处，换能器对准尾腹面固定。待动物稳定后，打开测量装置的操作系统，可见动脉脉搏信号出现。当规律性的脉搏波出现后，充气加压使加压套内压力升高到脉搏波完全消失，再加压升高4 kPa，之后缓慢放气，观察读取脉搏波及CAP。行再灌注前2 h、0h，再灌注后 2、4、6、8、10、12、13 h，各测一次，计算每个时间点CAP的平均值。在测定血压的同时，观察动物的状态，记录死亡时间，计算10d存活率。

1.4 血清LDH和CK活性测定

各组动物于深度全麻下，经右心房采血5 ml，在35℃恒温水浴箱中静置15 min，以3000r/min的速度离心5 min，取上清液送全自动生化分析仪检测LDH、CK活性。

1.5 肢体W/D测定

上述动物经心房采血后，从髋关节处截取左侧后肢，用电子分析天平先称湿重，在60℃电热恒温培养箱中干燥7 d，直到组织恒重，再测量肢体干重，计算肢体W/D值。

1.6 病理学观察

上述动物经心房采血后，从髋关节处截取右侧后肢。先对肢体肿胀程度、皮下渗出情况及坏死粘连程度、肌肉颜色、质地等进行大体观察。其后，剥去皮肤，将小腿部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，把小腿三头肌切成组织块，石蜡包埋、切片(5μm)，HE染色，光镜观察肌组织病理学变化。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 CAP和10d存活率观测结果

I/R组，再灌注后CAP开始下降，其过程可区分为四个时相:第一时相(再灌注0～2 h)，为血压快速下降期，至 2 h前后，CAP均值降为(8.6708±0.5992)kPa;第二时相(再灌注2～4h)，为血压相对稳定期，此期下降幅度较小;第三时相(再灌注4～8 h)，为血压缓慢下降期，此期血压下降的速率变缓，但持续降低，至再灌注8 h时CAP均值降为(5.3259±0.3832)kPa;第四时相(再灌注8 h～死亡)，为持续低血压期，CAP波动在5 kPa上下，动物处于持续休克状态，再灌注13～14h间有6只大鼠死亡，另外2只再灌注至20h前后死亡，10d存活率为0。与I/R组比较，RC组CAP下降的过程也可区分为四个时相:第一时相，血压下降较快，但下降幅度显著变小，再灌注至 2 h前后，CAP均值降到(10.3843±1.3111)kPa;第三时相，CAP下降的速率和幅度均明显降低，至再灌注 8 h时 CAP均值为(8.3300±0.4224)kPa;第四时相，血压不再下降，且稳中有升，至再灌注13 h前后CAP均值为(9.4157±0.3305)kPa，8只大鼠中1只在再灌注至20h前后死亡，其余7只再灌注10d后仍存活，且状态良好，10d存活率为7/8(图1，表1)。

Fig.1 Time course of mean caudal artery pressure before and after reperfusion in different groups

Tab.1 Mean caudal artery pressures after reperfused 2，8，13 hours in different groups(kPa，，n=8)

Tab.1 Mean caudal artery pressures after reperfused 2，8，13 hours in different groups(kPa，，n=8)

I/R:Ischemia/reperfusion group;RC:I/R after CO inhalation group*P＜0.05 vs I/R group

Group 2 h 8 h 13 h I/R 8.6708±0.59925.3259±0.38325.0767±0.3677 RC 10.3843±1.3111*8.3300±0.4224*9.4157±0.3305*

2.2 血清LDH、CK活性检测结果

血清LDH和CK活性相对值:I/R组 ＞RC组＞S组(表2)。

2.3 肢体W/D值

肢体W/D值:I/R组 ＞RC组 ＞S组(表2)。

Tab.2 Changes of limb wet/dry ratios，serum LDH and CK activities in different groups()

Tab.2 Changes of limb wet/dry ratios，serum LDH and CK activities in different groups()

S:Sham group;I/R:Ischemia/reperfusion group;RC:I/R after CO inhalation group*P＜0.05 vs S group;#P＜0.05 vs I/R group

Group n W/D LDH(U/L) CK(U/L)S 42.71±0.28 197.75±65.48 44.25±35.48 I/R 8 4.15±0.21* 561.38±85.53* 210.88±52.18*RC 8 3.60±0.25*# 389.131±46.44*# 152.50±44.66*#

2.4 病理学观察结果

大体观察:S组，肢体肌肉颜色暗红，形态正常，弹性好，皮下无出血及渗出物;I/R组，肢体明显肿胀，色泽深暗，弹性差，皮下组织内、肌间隔内有大量血色渗出液及大量浅黄色胶状渗出物;RC组，肢体的肿胀程度较I/R组明显减轻，颜色较I/R组略显苍白，弹性差，皮下组织、肌间隔内血色渗出液及胶状渗出物明显减少(图2)。

Fig.2 Gross observation of rat limbs in different groups

组织病理学观察:S组，骨骼肌细胞形态正常，胞浆均匀、红染，胞核无变形，核仁清晰;肌束明显，无炎性细胞浸润。I/R组，骨骼肌细胞胞体增大，部分肌细胞变性、坏死，肌浆溶解、破坏，胞核消失，呈空泡状;肌束断裂，肌细胞间有大量的中性粒细胞浸润，并见广泛出血灶。RC组，可见肌细胞变性的程度减轻，肌浆含有空泡，呈灶状溶解，肌细胞肿大程度减轻，肌浆、胞核染色趋近正常，未见核固缩;骨骼肌细胞间仍有单核细胞浸润，但数量减少;出血减轻(图3)。

Fig.3 HE stain for limb skeletal muscle longitudinal surface in different groups(×100)

3 讨论

临床资料显示，肢体挤压时间在4h以内者，所造成的I/R损伤相对较轻;肢体被持续挤压6 h以上者，可同时出现挤压伤和I/R损伤的表现，肢体肌组织严重肿胀、液化坏死，肢体伤残率很高。本课题组既往的研究证实，大鼠双侧后肢缺血4h，再灌注后所引发的I/R损伤较轻，在10d观察期内，动物没有出现死亡[2]。本实验结果显示，大鼠双侧后肢缺血8 h行再灌注，动物血压明显下降，再灌注至8 h时CAP降至5 kPa上下，此后呈持续低血压状态，再灌注至13-14h动物大部分死亡，10d存活率为0。该结果表明，本实验所复制的动物模型是一种肢体严重I/R损伤模型，再灌注后血压持续下降，直至休克死亡。

肢体被严重挤压后，受压部位及远端组织因缺血缺氧代谢障碍、结构破坏。在解除挤压恢复供血后，组织中氧浓度急剧升高，但不能被正常代谢利用，反而衍生出大量活性氧(ROS)等有毒介质。这些物质将进一步加重肢体的损伤。不仅如此，受伤肢体产生、释放的有毒物质进入血液循环后，可刺激激活多形核粒细胞(PMN)等血细胞及血管内皮细胞。这些细胞活化后，表达粘附分子，引起PMN贴壁、黏附、聚集。活化的 PMN可移出血管，以“呼吸爆发”的方式产生释放ROS、蛋白水解酶、髓过氧化物酶等，引起组织损伤。以上反应呈逐级放大效应，可激活更多的炎症细胞参与其中。最终，因血流变学发生紊乱，导致受伤肢体及肝肾等脏器的微循环障碍，因大量白细胞被扣押在组织内活化释放，引起全身性炎症损伤。据上分析，本实验I/R组第一时相的血压下降，可能由I/R肢体产生释放的ROS及炎症介质引发;血压下降引起外周阻力血管反射性收缩，使血压得以短暂企稳，这可能是第二时相的成因，是机体的代偿反应，该时相与休克Ⅰ期相当;当炎症级联反应导致血液流变学机能紊乱，进而出现微循环障碍时，便进入了第三时相，该时相与休克Ⅱ期相当;在大范围的微循环障碍和DIC发生后，便呈现出第四时相的持续低血压状态，第四时相与休克Ⅲ期相当。

目前，临床救治肢体严重挤压伤的措施主要有肢体切开减压和肾脏透析。前者是为了减轻再灌注引发的肢体水肿，后者是为了防治肢体I/R引发的肾功能障碍。更为严重的伤者，必要时要实施截肢手术。这些救治措施仍限于对症处理，如何从整体水平防治肢体重度挤压伤、阻止休克的发生，仍是一个亟待解决的难题。如上文分析，I/R损伤是有多细胞参与、多途径转导的全身性损伤。在治疗时，针对单一靶位进行干预的任何药物，都难以取得理想的效果。CO是气体信使分子，在组织内以弥散方式传递，能经不同信号途径对不同的效应细胞同时发挥调控作用。CO具有血管活性效应，对微循环障碍有改善作用，CO可抑制内皮细胞、PMN的活化，下调细胞间粘附分子(如ICAM-1)的表达，从而阻断中性粒细胞与内皮细胞的黏附，减少PMN扣押，CO能抑制溶酶体的释放及超氧化物的产生，阻断炎症介质的形成过程[3-7]。在肢体I/R的条件下，内源性CO的诱导酶表达上调，抑制该酶的活性则加重机体的损伤[8，9]。本实验观察到，使肢体I/R大鼠吸入CO后，其血压下降的速率和幅度明显降低，10d生存率显著提高，受伤肢体的W/D值及血清LDH、CK活性显著下降，病理学指标明显改善。该结果表明，在肢体I/R的病理状态下，及早给予适量外源性CO可逆转血压的下降，有效防止休克的发生，减轻肢体的损伤。其作用机制，可从前文述及的CO的生物效应及作用机制得到解释。

本研究结果提示，吸入CO的办法可能是防治肢体严重I/R损伤的一条重要途径。在地震、塌方等灾害的救治中，使肢体挤压伤的伤员及早吸入适量的CO，可对抗休克的发生，减轻肢体的损伤，且成本低廉、简便易行。值得进一步探讨的问题是，吸入CO防治肢体严重I/R损伤还有哪些适应症和禁忌症。

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