低氧暴露对大鼠外周血T淋巴细胞活化的影响*

田云梅，聂鸿靖，刘嘉瀛，张延坤，张东祥，汪 海

(军事医学科学院卫生学环境医学研究所军事环境医学研究中心，天津 300050)

我国高原地域辽阔，其中海拔3000m以上的高原主要分布在西部和西南部地区，约占全国总面积的1/4以上。人体快速进入3000m以上高原会因缺氧发生以呼吸、消化和中枢神经系统症状为主的急性高原反应，严重者会发展为高原肺水肿(high altitude pulmonary edema，HAPE)和高原脑水肿(high altitude cerebral edema，HACE)[1]，长时间低氧暴露会引发高原心脏病和高原红细胞增多症(high altitude polycythemia，HAPC)等慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)[2]。研究表明高原低氧导致机体免疫功能异常[3]，而这些功能异常可能与多种高原病的发生发展密切相关。这将严重影响高原进驻者的身体健康和高原作业效率，甚至危及生命，是亟待需要解决的问题。

低氧是一种应激刺激原，机体在刺激原的作用下，可以激发免疫细胞活化、分化和效应(免疫应答)。在免疫反应过程中，T淋巴细胞的活化依赖两个信号，即来自抗原与T细胞受体结合的第一信号和由抗原呈递细胞上的共刺激分子与T细胞表面的相应受体结合而产生的共刺激信号(第二信号)，T淋巴细胞表面共刺激分子提供的第二信号的缺乏，将会使 T细胞进入克隆无能状态或发生凋亡[4]。CD28是T细胞上表达的具有重要功能的共刺激分子，对T细胞的活化起正向协同作用，可促进T细胞增殖、活化、IL-2分泌及抗凋亡因子Bcl-2的表达。目前尚缺乏有关高原低氧环境下CD28在机体淋巴细胞上表达变化的相关研究报道，因此本研究观察了低氧暴露后大鼠外周血T淋巴细胞亚群及其活化共刺激分子的变化，为进一步揭示高原病的发病机制及其研究防治措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性Wistar大鼠，体重160～180g，随机分为常氧对照组和低氧暴露组，每组10只，实验动物由军事医学科学院实验动物中心提供(合格证号:SCXK-(军)2007-004)。

1.2 主要试剂及仪器

Anti-rat CD3-FITC、anti-rat CD4-PE-cy5、anti-rat CD8-Percp、anti-rat CD28-PE、溶血素及上样管均购自BD公司，其他试剂为国产分析纯。BD FACS Calibur流式细胞仪为BD公司产品，LDZ5-2型低速自动平衡离心机为北京医用离心机厂产品。

1.3 急性低氧暴露条件及取材

大鼠适应性饲养3 d后，对照组动物在常氧环境中饲养，低氧暴露组置低压舱内进行减压低氧暴露:以10m/s速度上升至5000m停留5 min，以同样速度上升至7000m停留3 min，再以同样速度上升至8000m。模拟海拔8000m低氧暴露8 h后，以20m/s的速度降至海平面高度，第2天以同样的方式进行低氧暴露，持续10d，分别于低氧暴露前及低氧暴露后8 h、3 d、6 d和10d采血，测定大鼠外周血T淋巴细胞亚群。

1.4 外周血T淋巴细胞亚群测定

1.4.1 样品管制备 自大鼠后眼眶静脉丛采血200μl，肝素抗凝 ，分别制备阴性对照管，CD3+、CD4+、CD8+、CD28+单阳性对照管和样品管(表1)，混匀后避光放置15 min。各管加2 ml溶血素，用涡旋震荡器充分混匀，使液体变透明，再避光放置9 min。500×g离心5 min，弃上清，加 2 ml PBS洗两次，后加700μl PBS重新悬浮，流式细胞仪测定各样品管T淋巴细胞亚群。

Tab.1 Preparation method of control tubes and sample tubes(μl)

1.4.2 流式细胞仪测定 打开cellquest软件，选择散点图，X轴为FSC，Y轴为SSC。打开获取条件窗口，调出获取条件 Detectors/Voltage，Threshold和Compensation。设定获取细胞数为10000，用阴性对照管调节细胞群，使细胞合理分布，选定淋巴细胞设门G1=R1，FSC＞120(图 1A)。选择散点图，X 轴为CD3，Y轴为SSC，用CD3单阳性管设定CD3阳性细胞，设门G2=R2(图1B)。再作三个散点图:设定X轴为 CD3、Y 轴为 CD28、G1=R1(图 1C);设定X 轴为CD3、Y 轴为 CD4或 CD8、G1=R1(图 1D-E);设定X 轴为CD4或CD8、Y 轴为CD28、G2=R2(图1F-G)。用阴性对照管调节FL1、FL2、FL3电压，使细胞群位于图的左下角，十字设定阴性、阳性细胞界限。用CD3单阳性管，对照图1C调节FL2-FL1%荧光补偿;用CD4或CD8单阳性对照管，对照图1F/G调节FL2-FL3%荧光补偿;用CD28单阳性管，对照图1 C和F/G，分别调节FL1-FL2%和FL3-FL2%荧光补偿。先获取阴性对照管细胞，然后依次上样，测定各样品管。

Fig.1 Schematic diagram of setting the parameter of flow cytometer

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 低氧暴露对大鼠体重的影响

模拟海拔8000m低氧暴露8 h后，低氧组大鼠体重(173.4±7.4)g较常氧对照组(183.8±6.0)g显著降低(P＜0.05);模拟海拔8000m低氧暴露3 d后，低氧组大鼠体重进一步降低(P＜0.01，167.7±7.5 vs 196.0±7.7)。随着低氧暴露时间的延长，低氧组大鼠体重增长率显著低于常氧对照组(P＜0.01)。

2.2 低氧暴露对大鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响

模拟海拔8000m低氧暴露8 h后，大鼠外周血CD3+、CD8+细胞数均显著降低 (P＜0.01，表2)，CD4/CD8显著增加(P＜0.05);低氧暴露6 d后，CD4+细胞数也显著降低(P＜0.01)。说明模拟海拔8000m低氧暴露早期，大鼠细胞免疫功能受到明显抑制。

Tab.2 Effect of hypoxia on peripheral blood T lymphocyte subsets in rats(，n=10)

Tab.2 Effect of hypoxia on peripheral blood T lymphocyte subsets in rats(，n=10)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs before hypoxia;#P＜0.05 vs hypoxia for 8 h;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs hypoxia for 3 d;▲ ▲P＜0.01 vs hypoxia for 6 d

Hypoxic time CD3+(%) CD4+(%) CD8+(%) CD4/CD8 Before hypoxia 66.66±4.46 44.77±5.00 21.27±3.31 2.15±0.36 Hypoxia for 8 h 59.04±7.14** 40.28±6.22 16.30±1.54** 2.48±0.36*Hypoxia for 3 d 57.95±5.78** 38.86±5.76 15.91±3.12** 2.53±0.64 Hypoxia for 6 d 55.92±5.97** 35.53±3.33**# 18.35±3.66* 1.99±0.34#△Hypoxia for 10d 51.36±7.68**△▲▲ 33.89±5.55**#△ 17.05±3.86* 2.03±0.34#△△

2.3 低氧暴露对大鼠外周血T淋巴细胞活化共刺激分子的影响

模拟海拔8000m低氧暴露8 h后，大鼠外周血CD8+CD28+、CD8+CD28-细胞数均显著降低;低氧暴露3 d后，CD4+CD28+细胞数显著降低(P＜0.01，图2A)，CD4+CD28-细胞数显著增加(P＜0.01，图2B)，CD8+CD28+、CD8+CD28-细胞数有所恢复;低氧暴露6 d后，大鼠外周血CD8+CD28+细胞数显著增加(P＜0.01，图2A)。说明模拟海拔8000m低氧暴露8 h和3 d后，大鼠外周血 CD8+、CD4+T淋巴细胞活化水平均显著下降，随着低氧暴露时间的延长，CD8+T淋巴细胞活化水平由降低变为增加。

3 讨论

在淋巴细胞中占相当比例的T淋巴细胞(CD3+)，根据其表面标志和功能特征，可分为CD4+和CD8+两个细胞亚群。CD4+细胞为辅助性T细胞，是免疫反应的中心细胞。CD4+T细胞在胸腺主要产生Th1型细胞和Th2型细胞，其中Th1型细胞可以产生IL-2，TNF-α，INF-γ等细胞因子，它们可以促进细胞介导的免疫反应;Th2型细胞可以产生如IL-4，IL-10等细胞因子，它们可以刺激B细胞产生抗体。CD8+细胞为细胞毒性T细胞，是免疫反应的效应细胞。研究表明模拟海拔8000m低氧暴露10d期间，大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+细胞数均有不同程度的下降，CD3+、CD4+细胞数下降趋势与小鼠试验基本相同[5]。实验结果提示模拟海拔8000m低氧暴露10d期间，大鼠细胞免疫功能紊乱。

Fig.2 Effect of hypoxia on peripheral blood CD28+and CD28-T lymphocyte subsets in rats(¯x ± s，n=10)

T细胞活化并发挥效应作用需要两个信号:一是抗原特异性刺激信号，另一个是T淋巴细胞协同刺激因子所提供的第二信号。T细胞表面有许多重要的共刺激分子，参与T细胞的活化、增殖及发挥效应功能，其中CD28是特异性细胞免疫应答所必需的信号。依据CD28的表达与否，可将T细胞分为CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD4+CD28+、CD4+CD28-四个细胞亚群。

CD8+CD28+T细胞是主要组织相容性复合体-1类限制性细胞毒前体细胞，具有MHC-1类限制细胞毒活性，在CD4细胞分泌的细胞因子作用下，分化为效应性杀伤T细胞[6];CD4+CD28+T细胞是代表大多数辅助性T细胞。本实验从T细胞活化共刺激分子角度研究低氧暴露对T淋巴细胞活化的影响，结果表明模拟海拔8000m低氧暴露8 h后，CD8+CD28+T细胞显著下降，低氧暴露 3 d后，CD4+CD28+T细胞也显著下降，提示低氧暴露早期T淋巴细胞活化水平降低。

CD8+CD28-T细胞具有短的端粒，分化能力比CD8+CD28+T细胞低，是一种终末细胞，是由于抗原的慢性刺激而由CD8+CD28+细胞分化而来，能直接作用于辅助性T细胞，可以通过抑制抗原提呈细胞CD40信号通路从而抑制CD4+T细胞的增殖。体外实验证明CD8+CD28-T细胞可以抑制IFN-γ的产生，从而对炎症疾病具有保护作用[7]。Komocsi等[8]报道，使用 anti-CD3 MAb刺激Wagener's肉芽肿患者外周血及肉芽肿内的CD4+CD28-T细胞，并体外克隆扩增24h后测定细胞因子水平，发现CD4+CD28-T细胞大量分泌 IFN-γ及TNF-α，与此同时在CD28分子缺乏时保持对IL-12的敏感性，扩大Th1细胞的效应。本次实验研究表明模拟海拔8000m低氧暴露 8 h后，大鼠外周血CD8+CD28-细胞水平显著性下降;低氧暴露3 d后，大鼠外周血CD4+CD28-T细胞数显著增加。

低氧暴露后，大鼠外周血T淋巴细胞亚群的这个变化过程可能有两种解释:一是高原低氧暴露后，促肾上腺皮质激素、环腺苷酸和糖皮质激素显著增加[9]，从而免疫系统受到抑制，机体可能通过减少对免疫反应的负调节作用和增加Th1型细胞因子的分泌来实现免疫反应的稳态，在此过程中可能会导致Th1型和Th2型细胞因子分泌失衡。二是在高原早期肺水肿患者的肺泡灌洗液中前炎症因子显著增加[10]，大鼠外周血T淋巴细胞的变化过程可能与低氧暴露后前炎症因子增加有关。

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