Apelin对大鼠离体肺动脉环的舒张作用及与一氧化氮的关系*

黄 萍，范小芳，庞玲霞，高钰琪，毛孙忠，胡良冈，洪 林，陈 然，龚永生，△

(1.温州医学院低氧医学研究所肺心病研究室，2.机能实验教学中心，3.科技处，浙江 温州 325035;4.第三军医大学高原医学教育部重点实验室，重庆 400038)

Apelin是从牛胃分泌物中提取出的新的小分子活性多肽，其受体是G蛋白耦联受体—血管紧张素受体AT-1相关蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT-1，APJ)[1]。有资料表明，在心血管系统方面，Apelin表现出独特的舒张血管、降低血压、增强心肌收缩力的双重有利效应[2，3]。我们前期的工作发现低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)大鼠心肺组织中Apelin-APJ系统明显改变，提示Apelin-APJ系统与HPH的发生发展密切相关[4]。新近，我们在整体模型上发现，经微量渗透泵给予Apelin-13对大鼠的HPH和肺血管重构有防治作用，其机制可能与一氧化氮途径有一定的关系[5]。本实验旨在离体水平上，观察Apelin对肺动脉环的舒张作用及其与NO途径的关系;并比较低氧大鼠的肺动脉环对Apelin的反应是否与正常大鼠存在差异。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

Apelin-13(以下简称Apelin)购自英国Tocris Inc;乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)，Nω-硝基-L-精氨酸甲酯[N(omega)-nitro-L-Arginine methyl ester，L-NAME]，可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂1H-[1，2，4]草酸重氮[4，3-α]喹嗯啉-1-酮 (1H-[1，2，4]oxadiazolo[4，3-α]quinoxaline-1-one，ODQ)购自Sigma公司;去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)购自上海禾丰制药有限公司，产品批号:6A11005。重碳酸盐缓冲液(Krebs-Henseleit，K-H 液):内含 NaCl 120，KCl 5.5，CaCl22.5，MgCl2◦6H2O 1.2 ，NaH2PO41.2 ，NaHCO320，EDTA-Na20.03 ，Dextrose10，单位为mmol/L ，pH 7.2～ 7.4。

1.2 实验动物分组及模型复制

清洁级雄性S D大鼠36只，体质量250～300g，由温州医学院实验动物中心提供[许可证号:SCXK(浙)2005-0019]。将大鼠随机分为正常组24只与低氧组12只，按照我室以往的方法[5]复制HPH的动物模型，即将低氧组大鼠置于常压低氧舱内，充入N2使氧浓度维持在9%～11%，CO2浓度维持在低于3%，每天8 h，每周6 d，连续4周。正常组除吸入空气外，其他条件与低氧组相同。

1.3 模型指标测定

大鼠饲养4周后，随机取正常组和低氧组各6只进行模型指标测定。术前禁食过夜，自由饮水。戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔麻醉，将右心导管自右颈外静脉插管至肺动脉，并行左颈总动脉插管，经PowerLab系统分别记录并计算平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)与平均颈动脉压(mean carotid arterial pressure，mCAP)。放血处死大鼠，迅速剪开胸腔取出心肺，剪去心房组织，沿室间隔剪下右心室，分别称量右心室(RV)和左心室+室间隔(LV+S)的重量，计算Herman-Willson指数=[RV/(LV+S)]，以反映右心室肥大程度。以mPAP与RV/(LV+S)作为慢性肺动脉高压和右心室肥厚的模型指标。

1.4 肺主动脉环的制备和肺动脉环张力的测定

颈椎脱臼法处死大鼠并迅速打开胸腔，取出心肺，小心去除肺动脉周围结缔组织后将血管剪成约3～4 mm宽的血管环，将血管环放入含K-H液的浴槽内，持续通以95%O2+5%CO2的混合气体，缓慢将静息张力调至1000mg;37℃下稳定90min，期间每15 min换液一次。待血管稳定后，向浴槽中加入1μmol/L的NE使血管收缩，待肺血管收缩稳定后开始实验。

1.4.1 血管舒张效应的检验 10μmol/L ACh作用后血管舒张60%～80%，则认为内皮完整;如舒张幅度小于10%，则视为去内皮成功。以加入药物后的血管张力变化幅度与NE诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。

1.4.2 Apelin对大鼠肺动脉环的舒张作用 观察向浴槽内加入不同浓度的Apelin后，正常大鼠内皮完整(n=18)的、去内皮(n=8)的和低氧大鼠(n=10)的肺主动脉环张力的变化。Apelin终浓度分别为 0.01 nmol/L 、0.1 nmol/L、1 nmol/L 、10nmol/L 、100nmol/L。每隔1 min加一次药。

1.4.3 L-NAME、ODQ对Apelin舒张大鼠肺动脉环作用的影响 在正常组大鼠离体肺动脉环的浴槽中加入终浓度达 10μmol/L的L-NAME或ODQ(n=18)，预孵育血管半小时后，换液，再向浴槽内加入1μmol/L NE，待收缩平衡后，依次向浴槽内加入Apelin，终浓度为 0.01 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10nmol/L 、100nmol/L。

1.5 统计学处理

用不同浓度下的血管收缩值制备剂量-效应曲线，在每次实验中分别计算舒张百分数，半数有效浓度(EC50)值用Scatchar法将浓度-效应曲线转化为直线后通过回归运算求得。数据用SPSS 11.5统计学软件进行统计，两组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 Apelin对NE预收缩的肺主动脉环张力的影响

在0.01～100nmol/L的浓度范围内，Apelin具有浓度依赖性舒张内皮完整的正常离体大鼠肺主动脉环的作用，在Apelin浓度为100nmol/L时对预收缩的肺主动脉环的舒张率达到10.62%±2.60%(图1)。

Fig.1 Vasorelaxation to apelin on normoxic rat pulmonary arterial rings

Fig.2 Relaxation of apelin on rat main pulmonary arterial rings and effects of endothelium-denude

Fig.3 Relaxation to apelinon normoxic rat main artery:effectsof L-NAME or ODQ

2.2 Apelin对去内皮大鼠肺动脉环舒张效应的影响

去内皮后，各浓度Apelin舒张正常大鼠肺动脉环的效应明显减弱(P均＜0.01，图2)。

2.3 L-NAME和ODQ对Apelin舒张大鼠离体肺主动脉环效应的影响

用一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)或可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)抑制剂(ODQ)预孵育后，各浓度Apelin舒张正常大鼠肺动脉环的效应明显减弱(P均＜0.01，图3)。

2.4 慢性低氧性肺动脉高压大鼠模型的建立

低氧组大鼠的mPAP与RV/(LV+S)分别比正常组高40.1%(P＜0.01)、32.0%(P＜0.01)，两组间的mCAP无显著性差异(P＞0.05，图4)。

Fig.4 Changes of mPAP，RV/(LV+S)and mCAP

2.5 Apelin舒张慢性HPH大鼠离体肺动脉的效应

HPH大鼠离体肺动脉环对Apelin的反应减弱，在浓度为100nmol/L时，Apelin对低氧组肺主动脉离体血管环的舒张幅度下降60.5%(P＜0.01，图5)。低氧组 EC50=(1.02±0.21)nmol/L，正常组EC50=(0.81±0.25)nmol/L，两组间无显著性差异(P＞0.05)。

Fig.5 Vasorelaxation to apelin in hypoxic ratmain pulmonary arteries

3 讨论

Apelin是新发现的具有维持体液稳态、调节垂体激素分泌、摄食、呼吸和生物节律等多功能的活性肽。在人与哺乳动物的多种组织器官(心脏、肺、血管、脑、肾等)中均发现Apelin及其受体APJ mRNA和蛋白的表达，其中以肺脏中的联合表达最高[6]，这提示:Apelin-APJ系统对肺循环稳态的调节可能具有特殊的意义。以往的离体实验对Apelin舒张血管效应的研究大多集中在胸主动脉、肠系膜动脉、肾动脉等血管上[7，8]。本实验结果显示，在以去甲肾上腺素引起的预收缩的大鼠离体肺主动脉环模型上，Apelin对大鼠肺主动脉环具有舒张作用。实验还发现，Apelin对去除内皮后的肺动脉环的舒张效应明显低于内皮完整组。其机理可能是内皮细胞上存在G蛋白耦联受体APJ，而Apelin是APJ的内源性天然配体，Apelin与APJ结合后上调NO而发挥扩张血管的作用[7，9]，所以当血管去除内皮的同时也破坏了内皮上APJ，致使Apelin经血管内皮APJ途径的舒张血管作用消失。

Tatemoto等[3]发现，Apelin在体内可增加NO的生成，其舒张血管效应在很大程度上通过NO信号途径介导。另外，在离体孵育的大鼠主动脉组织上发现，Apelin可浓度依赖性增加大鼠主动脉NO的生成及NOS活性，提示Apelin舒张血管效应与NO/NOS系统密切相关[7]。本实验发现:对于正常大鼠的肺主动脉环，一氧化氮合酶抑制剂L-NAME能明显抑制Apelin的舒血管效应，首次在离体水平上提示Apelin舒张肺动脉的作用与NO/NOS系统有关，这与我们在整体实验上所发现的Apelin对HPH和肺血管重构的防治作用与NO途经有关的结果相一致[5]。已知NO是在内皮NOS的作用下由L-精氨酸转化而来，并通过激活平滑肌细胞sGC，增加cGMP含量而使血管平滑肌舒张[9]。本实验结果还表明，sGC抑制剂ODQ明显抑制Apelin的舒血管效应，提示NO-sGC-cGMP信号途径介导了Apelin舒张肺血管的作用。

本实验结果显示:低氧组较正常组大鼠的mPAP、RV/(LV+S)显著升高，这表示肺动脉高压模型已建立成功。与正常组相似，Apelin呈浓度依赖性地舒张低氧大鼠的离体肺主动脉环，但舒张效应明显低于正常组。这与Salcedo A、Zhong JC 等[7，8]报道Apelin对病理状态下离体肠系膜动脉、主动脉的舒张效应减弱相类似。结合文献，Apelin对HPH大鼠离体肺主动脉的舒张效应降低可能是由于:一方面，HPH大鼠肺主动脉Apelin的受体APJ可能下调，致使Apelin经Apelin-APJ系统发挥的舒血管效应减弱。两组EC50比较无显著性差异，说明同一半数有效浓度的Apelin作用于低氧大鼠肺血管内皮时可能由于APJ受体减少而使Apelin与APJ的结合减少、亲和力减弱，从而使Apelin对血管的舒张作用减弱。另一方面，Apelin舒张血管的效应具有明显的血管内皮依赖性，而在HPH的发生过程中，可能导致血管内皮细胞功能障碍(如存在NOS的释放不足等)，使得血管本身对Apelin等小分子活性物质的反应降低。此外，Apelin对低氧组肺主动脉的舒张效应明显减弱也可能与低氧情况下肺细小动脉管壁增厚，中层平滑肌增生，使得肺血管收缩反应增强和肺血管重建有关。

综上所述，Apelin具有内皮依赖性的舒张大鼠离体肺动脉环的作用，该作用主要通过NO-sGC-cGMP途径来实现。对于低氧大鼠的离体肺动脉环，Apelin的舒张效应减弱。

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[4]黄 萍，龚永生，范小芳，等.葛根素对低O2高CO2性肺动脉高压大鼠右心室Apelin/APJ系统的影响[J].中草药，2008，39(4):565-569.

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