MMP-2对人肾系膜细胞 Fractal kine释放的影响

方 铭，吴心池，黄文龙，施广德

(江阴市人民医院，江苏江阴 214400)

金属蛋白酶(MMPs)是一组具有类似结构和共同生物化学性质的金属依赖性蛋白水解酶，能降解除多糖以外的所有细胞外基质(ECM)成分，从而影响细胞的增殖、分化、迁移、凋亡以及细胞间的相互作用等许多重要过程[1]。趋化因子 Fractalkine(Fkn)是 CX3C亚族成员，在肾系膜细胞、肾小管上皮细胞、肾小球和肾小管间质组织等都有表达，且与炎性组织的单个核细胞浸润显著相关，不仅具有趋化作用，还具有促进细胞黏附、介导免疫损伤、细胞毒等功能[2]。 2009年 8月 ～2010年 10月 ，我们以体外培养的人肾系膜细胞(HRMC)为模型，观察MMP-2对不同状态下 HRMC干预后上清中趋化因子 Fkn释放的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 HRMC株(为 T-SV40及 H-ras原癌基因转染)、人重组 MMP-2(PeproTech公司)、人 Fkn 96孔 ELISA试剂盒(R＆D公司产品)、人 Fkn ELISA试剂盒(武汉博士德公司产品)、RT-PCR试剂盒(Fermentas)、国产分析纯、CO2恒温培养箱(NAP2CO)、洗板机 (Model 1575，BIO-RAD产品 )、酶标仪(Model 550 BIO-RAD产品)。

1.2 方法 将处于对数生长期的细胞按 1∶3移入6孔板中，待细胞生长 80%～90%融合时，换用无血清的 DMEM同步化饥饿 24 h，按下列分组进行干预。①空白对照组:不同浓度的激活 MMP-2(0.625、1.25、2.5、5.0 ng/ml)对 HRMC作用 4 h，同时不加干预剂作为对照组，然后收集上清。②BSA组:BSA(浓度为 200 mg/L)干预 HRMC 24 h后再加用以上 4种不同浓度的激活 MMP-2对 HRMC作用4 h，同时不加干预剂作为对照组，然后收集上清。③AGE-BSA组:AGE-BSA(浓度为 200 mg/L)干预HRMC 24 h后再加用以上 4种不同浓度的激活MMP-2对 HRMC作用 4 h，同时不加干预剂作为对照组，然后收集上清。ELISA法检测培养上清 Fractalkine蛋白质水平，按照人 Fractalkine 96孔 ELISA试剂盒说明进行，实验重复 3次，结果取平均值。

1.3 统计学方法 应用 SPSS13.0软件包，数据用±s表示，组间比较采用S-N-K检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

综合比较，重组人 MMP-2干预后 3组上清中的Fkn的浓度均明显下降(P均 ＜0.01)，AGE-BSA组Fkn表达量较空白对照组明显升高(P＜0.05)。空白对照组在基础状态下，HRMC表达 Fkn(236.42±16.25)pg/ml;重组人 MMP-2干预后，上清中 Fkn浓度表达量随着 MMP-2浓度的增加而明显下降(P均＜0.05)。BSA组在 BSA 200 mg/L状态下，HRMC表达 Fkn(364.33±9.15)pg/ml;重组人 MMP-2干预后，上清中 Fkn浓度表达量随着 MMP-2浓度的增加而明显下降(P均 ＜0.05)。AGE-BSA组在 AGEBSA 200 mg/L状态下，HRMC表达 Fkn(1 055.46±26.24)pg/ml;重组人 MMP-2干预后，上清中 Fkn表达量随着 MMP-2浓度的增加而明显下降(P均 ＜0.05)。见图1。

图1 不同浓度 MMP-2对 HRMC培养上清 Fkn浓度的影响

3 讨论

糖尿病肾病(DN)的发病机制十分复杂，糖基化终产物(AGEs)堆积是 DN的主要发病机制之一。AGEs促进肾小球系膜细胞增殖和 ECM增多。炎性细胞浸润和 ECM代谢失衡是 DN发生发展中 2个最重要的病理生理环节，趋化因子吸引单核巨噬细胞进入肾小球系膜区和肾小管间质是始动 DN的早期事件，而 ECM积聚则构成 DN主要病理改变——基底膜增厚、系膜扩张最终发生肾小球硬化和肾间质纤维化的分子基础[1，2]。

目前，对于 DN中 MMP-2与 Fkn的相互作用还不清楚。因此，我们假设在 DN早期，持续高血糖、AGEs等作用下，导致 ECM生成和降解动态平衡的重要体系遭到破坏，可以导致肾系膜细胞等肾小球组织产生和分泌 Fkn增加。一方面，Fkn兼具趋化与黏附特性，促进单核巨噬细胞在肾小球系膜区浸润与聚集，而它们通过自分泌或者旁分泌的作用始动并加速 DN的发生发展;而另一方面，Fkn作用于单核巨噬细胞，使 MMP-2和 MMP-9的产生及分泌减少，从而使各型胶原、纤维连接蛋白等 ECM成分降解减少，ECM异常积聚，ECM生成和降解动态平衡遭到破坏，从而促进 DN的发生发展[3，4]。

本研究结果显示，AGE-BSA增加 HRMC的合成和释放 Fkn，其可能的机制为:AGEs刺激糖尿病患者肾系膜细胞产生和分泌 Fkn，Fkn趋化、黏附单核巨噬细胞到达肾系膜区并促使它们沉积于系膜细胞参与 DN发生的早期事件;同时，AGEs通过对浸润的单核巨噬细胞旁分泌作用和(或)自分泌作用抑制肾系膜细胞和单核细胞 MMP-2表达及其活性，不仅使 ECM积聚增加，而且影响了 MMP-2对 Fkn的效应，减少了 Fkn的裂解，从而导致Fkn发挥细胞黏附、细胞毒性、迁移作用，形成恶性循环。应用MMP-2干预 HRMC后上清中的 Fkn减少，其可能的原因为:①HRMC合成和分泌 Fkn减少;②Fkn被MMP-2裂解成小肽，ELISA方法无法测出;③Fkn和单核细胞膜上受体结合而不能被测出[5]。

本研究模型为体外培养 HRMC，而体内环境更为复杂，受干扰的因素更多，况且糖尿病常合并有其他疾病。DN的发生是一个多步骤、多因素参与的病理过程，实验室的环境不能完全模拟体内环境，且细胞株经反复传代后，其形态和功能都可能发生一定程度的改变。故该结论尚需反复进行实验进一步证实。

[1]Elkington PT，O'Kane CM，Friedland JS.The paradox of matrix metalloproteinases in infectious disease[J].Clin Exp Immunol，2005，142(1):12-20.

[2]Chafer A，Schulz C，Fraccarollo D，et al.The CX3C chemokine fractalkine induces vascular dysfunction by generation of superoxide anions[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27(1):55-62.

[3]杨益宁，孙子林，杨涛，等.糖基化终产物对人肾系膜细胞 MMP-2表达的影响[J].东南大学学报(医学版)，2006，25(5):349-352.

[4]Baricos WH，Cortez SL，Dahr SS，et al.ECM degradation by cultured human mesangial cells is mediated by PA/plasmin/MMP-2 cascade[J].Kidney Int，1995，47(4):1039-1047.

[5]陈海燕.Fractalkine及其受体 CX3CR1与临床疾病[J].华西医学，2005，20(2):409-410.