生物羊膜对兔小梁切除术后碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

宋爱萍，王建荣，郭百灵，刘 伟

(济南市第二人民医院，济南 250001)

羊膜作为一种生物组织移植材料，已广泛应用于眼表疾病的治疗，在眼表重建中发挥了重要作用[1～4]。2007年 12月 ～2008年 6月，我们将生物羊膜和丝裂霉素 C应用于兔高眼压模型小梁切除术中，以观察其抗纤维组织增殖的作用。

1 材料与方法

1.1 高眼压动物模型的建立 健康成年同种系新西兰大耳白兔 30只(普通级，由济南市动物实验中心提供)，体质量 2～3 kg，雌雄兼用，无眼疾，常规喂养。兔双眼均用 10 g/L丁卡因角结膜表面麻醉 3次，于 9:00位角巩膜缘 1 ml针穿刺放出部分房水，α2糜蛋白酶 160 U后房注入，3 min内注射完。观察眼压变化，若 3 d后(即青光眼手术前)眼压仍低于 21 mmHg，则后房补充注入 α2糜蛋白酶 80 U，2 min内注射完，方法同前。所有操作完成后兔眼前房形成良好，眼压 21 mmHg示高眼压动物模型建立成功。

1.2 动物分组、处理及观察 30只兔动物模型随机分为 3组，每组 10只(20眼)。A组行小梁切除+生物羊膜植入术，B组行小梁切除联合巩膜瓣下放置浸有丝裂霉素 C棉片 3 min，C组单纯小梁切除。手术均由同一位熟练掌握小梁切除术的医师完成 。于术后第 3、7、14、21、28天用耳前静脉空气栓塞法处死 A、B、C组各 2只，立即摘除眼球，取滤过泡区组织(结膜、巩膜)4 mm×2 mm放入甲醛中固定 48 h以上。常规行脱水、石蜡包埋、二甲苯透明、垂直角膜缘方向包埋，4μm厚连续切片，常规组织 HE染色，光镜观察滤过道内羊膜溶解吸收情况、成纤维细胞增生及炎细胞浸润等组织病理学改变。每例标本任选一张切片，进行免疫组织化学碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)检测，用 CIAS-1000型图像分析系统分析阳性细胞数。术后观察兔眼滤过泡形态、充血程度、前房房水细胞和蛋白情况。

1.3 统计学方法 采用 SPSS10.0统计软件，b-FGF阳性细胞数以±s表示，组间比较采用 t检验;各组滤过泡差异采用 χ2检验(含四格表确切概率法)。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 滤过泡 根据 Krofeld分型法，将滤过泡的形态功能分为 4型。Ⅰ型、Ⅱ型为功能性滤过泡，Ⅲ型、Ⅳ型为无功能性滤过泡。各组滤过泡第 1～3天较扁平，以后弥散隆起，小梁切除组第 14天后逐渐瘢痕化，第 30天变得扁平。A、B组功能性滤过泡所占比例与 C组相比有统计学意义(P＜0.05)，A、B组之间差别无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 前房反应及并发症 术后第 1、2天，A组前房反应较重，第 3天后 3组前房反应均消失。A组术中有 1例出现前房出血，于 1周完全吸收。B组出现 1例前房出血(术后 1周基本吸收)、1例浅前房、1例滤过泡瘘、1例角膜上皮剥脱。

2.3 切片 HE染色 术后第 3天 A组手术区大量炎症细胞浸润，B、C组手术区见中等量炎症细胞浸润。第 7天时 A组滤过区均可见一定的滤过空腔，无明显纤维组织增生;C组滤过区可见少量滤过空腔、血管长入、纤维增生明显、排列紊乱。第 14天 A组炎症细胞减少，成纤维细胞数目明显低于 B、C组。C组可见多量炎性细胞、大量胶原纤维增生、血管长入、滤过腔大部分消失。术后第 21天 A组纤维组织增生，结缔组织胶原化，羊膜断裂成片状、仍有滤过空腔存在;C组滤过腔消失，滤过区则被覆大量增生的纤维组织，瘢痕形成，滤过腔关闭。

2.4 三组 b-FGF阳性细胞数比较 免疫组化检测b-FGF阳性染色为棕黄色，各组术后第 3、7、14、21、28天兔眼手术区域 b-FGF阳性细胞计数见表1。

3 讨论

表1 三组术后不同时间兔眼手术区 b-FGF阳性细胞数(个/HP，±s)

表1 三组术后不同时间兔眼手术区 b-FGF阳性细胞数(个/HP，±s)

注:与 C组比较，*P＜0.05;与B组比较，△P＜0.05

组别 术后第 3天 术后第 7天 术后第 14天 术后第21天 术后第 28天A组 7.58±2.24*△ 14.33±2.15*△ 13.64±1.28*△ 12.06±1.35*△ 10.85±2.01*△B组 5.18±1.41* 13.15±2.13* 12.87±1.28* 9.97±1.72* 9.08±2.01*C组 12.76±1.29 20.53±2.48 16.93±2.11 14.14±1.79 12.53±1.95

在成纤维细胞增殖、瘢痕形成的过程中，有众多因子起作用，其中以 b-FGF、TGF-β作用最为显著[5，6]。体外实验表明，0.1 ng/ml的 b-FGF可明显地刺激成纤维细胞、内皮细胞等的增殖和胶原的合成[7]，同时它又是一种趋化因子，对内皮细胞、成纤维细胞和星形胶质细胞均有趋化作用，并可能参与新生血管性青光眼的形成以及青光眼滤过术后角巩膜缘组织的愈合等过程[8]。甚至有报道称，TGF-β对结膜囊成纤维细胞的刺激效应是通过 b-FGF的介导而发挥作用[9]。本研究中，A组术后第 7天见到少量 b-FGF阳性细胞，纤维增殖受到抑制。术后第 14天 b-FGF阳性细胞开始减少，纤维增殖不明显。B组 b-FGF阳性细胞数较 A组少，而 C组 b-FGF阳性细胞表达明显，随着时间延长房水滤过道内纤维增殖严重，瘢痕形成。表明生物羊膜可以通过抑制 b-FGF的表达抑制成纤维细胞形成，起到防止滤过泡粘连、瘢痕形成的作用。

丝裂霉素 C对成纤维细胞有明显的抑制作用，因而可用来阻止手术区的血管再生，抑制青光眼滤过性手术后滤过道的纤维细胞增生和瘢痕形成，保持滤过道的通畅。丝裂霉素 C能引起角膜上皮剥脱、低眼压、浅前房等，这种并发症尽管发生例数少，但可对患者视力造成损害，有时甚至是不可逆的。我们也发现 A组和 B组均形成良好的功能滤过泡，但 B组不良反应多。本文应用的生物羊膜是通过生物工程技术对羊膜进行生物学改良，改变羊膜结构(去羊膜上皮细胞或改变上皮细胞的性质)及成分(吸附特殊的药物，使羊膜固有化学成分发生改变)，在保存羊膜基本生理特性的同时赋予其更多的生物学功能。应用生物羊膜克服了自制新鲜羊膜或低温保存羊膜被污染的可能性，同时又最大程度保证了临床应用的合法性和科学性[10]。

总之，羊膜和丝裂霉素在青光眼滤过术中都有较好的抗增殖作用，但术中应用羊膜并发症少，无不良反应，是一种安全有效的治疗方法。

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