大鼠胰腺原位灌注实验模型的建立及可行性研究

孙富军，李代清，张秋梅，汤云昭，郭 刚

(1天津医科大学内分泌研究所，天津300070;2天津医科大学代谢病医院)

由于整个机体与器官间的相互影响，在活体内进行某一器官的生理学和药理学研究非常困难。胰腺离体灌注作为一种体外技术可有效排除体内其他因素干扰，较准确评价研究因素对胰腺组织中胰岛β细胞分泌功能的影响。有关大鼠胰腺整体组织不离体情况下进行灌注实验的可行性鲜见报道。2010年3月，我们采用不离体方式对大鼠胰腺整体组织进行灌注实验，并用L型钙通道阻滞剂——依拉地平对其可行性进行了验证。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠10只，8周龄，体质量220～250 g，适应性饲养1周;戊巴比妥钠，依拉地平(英国Tocris公司)，125I胰岛素放射免疫分析药盒;Modified Krebs-Ringer HEPES缓冲液(调节pH值至7.4)，分别加入葡萄糖制成低糖灌注液(含3.3 mmol/L葡萄糖)和高糖灌注液(含16.7 mmol/L葡萄糖)，在后者中加入50 nmol/L依拉地平制成依拉地平—高糖灌注液;聚乙烯管，双显恒温加热器SH-3，快速恒温数显水箱HH-42，蠕动泵，拜安易血糖仪。

1.2 动物分组及灌注模型制备 将10只大鼠随机分为观察组和对照组各5只，并进行下列处理:禁食12 h，自由饮水，用戊巴比妥钠(40mg/kg)行腹腔注射麻醉，按文献［1，2］操作步骤将胰腺与脾、胃和结肠等组织器官分离;在腹主动脉的腹腔干上方结扎，在肠系膜上动脉开口下方1cm处腹主动脉壁上剪一切口，置入灌注管并固定;于门静脉肝门分叉处剪一切口，插管并固定，插管导出体外后将腹部切口缝合;启动蠕动泵通过腹主动脉插管向胰腺组织灌注肝素生理盐水，至门静脉流出液清亮。

1.3 胰腺原位灌注和胰岛素分泌参数检测 将两组大鼠放在37℃恒温加热器上保温，按图1连接蠕动泵，先用37℃ Modified Krebs-Ringer HEPES缓冲液以1 ml/min流速预灌注40min，使胰腺组织的温度和功能状态近似生理水平。其后观察组分别以低糖灌注液灌注10min、依拉地平—高糖灌注液灌注25min，对照组分别以低糖灌注液灌注10min、高糖灌注液灌注25min。用4℃预冷并加有20 μl抑肽酶(浓度为250 μg/ml)的 eppendorf管收集两组门静脉插管的流出液，-20℃保存。用放射免疫分析法检测上述门静脉流出液中胰岛素水平，计算下列指标:胰岛素分泌率=每分钟胰腺流出液中胰岛素浓度×灌注流速，基础胰岛素分泌率=低糖灌注液灌注期间胰岛素曲线下面积÷灌注时间;葡萄糖刺激的胰岛素分泌率=高糖灌注液灌注期间胰岛素曲线下面积÷灌注时间［1］。

图1 大鼠胰腺原位灌注装置简图

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理。计量资料以±s表示，组间比较采用配对t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

两组胰腺胰岛素分泌参数见表1，胰腺原位灌注后胰岛素分泌曲线见图2。

表1 两组胰腺胰岛素分泌参数比较(μIU/min，±s)

表1 两组胰腺胰岛素分泌参数比较(μIU/min，±s)

注:与对照组比较，▲P＜0.01

组别 n基础分泌率 分泌峰值 第1时相分泌率(第11～15min)第2时相分泌率(第16～35min)观察组 5 206±20 519±37▲ 391±21▲ 322±33▲对照组 5 201±17 1 041±116 715±33 530±36 P值0.671 0.001 0.000 0.000

图2 大鼠胰腺原位灌注后胰岛素分泌曲线

3 讨论

大鼠胰腺离体灌注技术是指将胰腺与脾、胃和结肠等组织器官分离后，从腹腔内取出并转移至一个装有37℃缓冲液的恒温容器中，再通过特定实验装置自腹主动脉插管泵入灌注液，在门静脉插管收集流出液，进而对胰腺进行单独研究的灌注实验［2］。该实验主要用于糖尿病及其相关疾病大鼠模型胰岛功能的研究，可较准确评价研究因素对胰腺组织中胰岛β细胞分泌功能的影响。大鼠胰腺原位灌注技术指在成功实施胰腺分离术后，不将胰腺取出体外进行操作，经腹主动脉插管后直接对胰腺进行灌注，此可避免将胰腺取出体外操作时可能对胰腺组织造成的机械性损伤，使胰腺组织完整性更有保障。

胰岛β细胞对胞外葡萄糖浓度变化十分敏感。葡萄糖浓度升高时，β细胞通过膜上的葡萄糖转运体摄入葡萄糖，经代谢使胞内ATP/ADP比率增加，导致ATP敏感的钾通道(KATP)关闭，细胞膜去极化，电压依赖型钙通道开放，Ca2+内流，胞内Ca2+浓度升高，触发胰岛素释放，其中第1时相反映在急性刺激下胰岛β细胞贮存颗粒中胰岛素快速释放能力;第2时相持续时间长、分泌总量大，反映胰岛β细胞持续分泌胰岛素的能力。L型钙通道是人和大鼠胰岛 β 细胞上主要的钙离子通道［3，4］，在胰岛素分泌过程中发挥重要作用;依拉地平是一种L型钙通道阻滞剂，可使钙离子内流受阻、β细胞胰岛素分泌受抑。本研究显示，①两组基础胰岛素分泌率无显著差异，均呈现低水平状态。②对照组在第1时相胰岛素分泌水平迅速升高，分泌高峰出现在第12min，随后迅速下降，并在一个较高水平稳定波动(即第2时相);观察组胰岛素分泌峰值及胰岛素第1、2时相分泌率均显著低于对照组。提示本实验成功建立了大鼠胰腺原位灌注模型，且可用于胰岛β细胞功能及相关药理学实验的动态研究。

综上所述，胰腺原位灌注模型较体外灌注模型更易于操作，且同样具备可定量、可重复、可动态观察等优点;此为胰岛β细胞功能的研究提供了一种有效实用的方法。

［1］赵乃倩，余叶蓉，谭惠文，等.大鼠胰腺离体灌注技术的建立［J］.中华内分泌代谢杂志，2007，23(5):459-463.

［2］Wargent ET.The measurement of insulin secretion using pancreas perfusion in the rodent［J］.Methods Mol Biol，2009，(560):203-219.

［3］Herbst M，Sasse P，Greger R.Membrane potential dependent modulations of calcium oscillation in insulin-secreting INS-1 cell［J］.Cell Calcim，2002，31(3):115-126.

［4］PolloA，Lovallo M，Biancardi E，et al.Sensitivity to dihydropyridines，omega-conotoxin and noradrenaline reveals multiple high-voltage-activated Ca2+channels in rat insulinnoma and human pancreatic beta-cells［J］.Pfugers Arch，1993，423(5-6):462-471.