成人骨髓源内皮祖细胞的体外分离培养及鉴定

温 昱，李 彬，党瑞山，张传森

(1中国医科大学组织胚胎学教研室，沈阳110001;2中国医科大学附属盛京医院;3中国人民解放军第二军医大学解剖学教研室)

自Asahara等发现并分离培养外周血中内皮祖细胞(EPCs)后［1］，许多研究陆续证实EPCs对创伤愈合、肢体缺血、心肌梗死、血管移植物再血管化、随意皮瓣存活、移植皮肤血管新生等过程中的血管再生起重要作用［2］。目前关于大鼠、兔和犬骨髓来源EPCs的体外分离、培养及鉴定方法已有报道［3～5］，但关于成人骨髓EPCs体外纯化、培养及鉴定的报道较少。2010年5月，我们对成人骨髓源EPCs进行了体外分离培养及鉴定，旨在为其临床研究和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 CD133一抗及微珠，CD133-FITC，CD34-PE，FITC-二抗，Cy3-二抗，CD34，CD31，CD133，内皮细胞生长培养基(EGM)-MV2，DMEM-低糖培养基(LG)血管内皮细胞钙依赖性黏附素(VE-cadherin);成年男性纯化骨髓细胞。

1.2 细胞扩增、纯化 将成年男性骨髓采用含20%FBS的DMEM-LG于体外进行全骨髓培养，传代后采用CD133免疫磁珠分选细胞，将得到的纯化骨髓细胞加入含EGM-MV2的培养瓶中培养，细胞生长至80%～90%融合时PBS洗涤2次，0.25%胰酶37℃消化1min，吸管吹打至细胞完全脱壁为单细胞悬液，1 000 r/min离心5min，弃上清;EGM-MV2重悬细胞，以(1～2)×105/ml重新接种于25cm2培养瓶中。

2 结果

2.1 细胞扩增及培养 分选后细胞大部分在24 h内贴壁，初时体积较小，呈类圆形或多角形;第3天贴壁细胞以生长良好的细胞为中心，呈集落样生长，集落边缘细胞形态伸张为梭形或长多角形，达80%～90%融合需5～6 d。传代细胞形态为短梭形，生长潜伏期不足1 d，倍增时间约为2 d;第6～7 d达60%融合，细胞多数分散均匀生长，呈典型串珠样排列;经过2～3代后可获得(1～2)×106个细胞，基本可达移植和细胞诱导分化要求的数量。

2.2 细胞生长周期 EPCs接种第2天细胞数量即开始增加，对数生长期为3～6 d，至第7天数量达4.43×105/ml，之后进入平台期，见图1。

图1 EPCs生长曲线

2.3 细胞纯度 经CD133免疫磁珠分选后细胞百分率分别为24.13%、93.29%。

2.4 细胞鉴定情况 ①表面特异标志:EPCs表达CD133、CD34和 VE-cadherin，不表达 CD45和 CD31。②超微结构:细胞核不规则、核质比大，胞质内见致密内皮颗粒。③吞噬功能:激光共聚焦显微镜显示Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双染色均为阳性。

3 讨论

EPCs为内皮细胞的前体细胞，属多能干细胞，存在于骨髓、脐血和外周血中，可分化为内皮细胞［6］;文献报道 EPCs有吞噬低密度脂蛋白的功能［7］。相对于外周血和脐血来说，骨髓中EPCs的含量更为丰富，且易于获取和体外分离培养，增殖能力强，属自体来源，无免疫排斥反应。因此，本实验选择骨髓来源EPCs作为研究对象。目前对EPCs的常用分离方法包括单个核细胞贴壁分离法、密度梯度离心分离法和根据细胞表面标志通过流式细胞仪或免疫磁珠分离出阳性细胞群，然后采用条件培养基贴壁培养［8～10］。单个核细胞贴壁分离法易于操作、费用低、仪器要求不高，但得到的EPCs纯度较低;而根据细胞表面标志获得的细胞纯度较高，利用CD133作为EPCs的表面标记进行分离可除去内皮细胞干扰，从而使分离细胞更为纯化。

本研究显示，分离的细胞达80%～90%融合需5～6 d，倍增时间约为2 d，经2～3代后基本可达移植和细胞诱导分化要求的数量;EPCs接种第2日细胞数量即开始增加，对数生长期为3～6 d，至第7天数量达4.43×105/ml;经CD133免疫磁珠分选后，细胞百分率分别为24.13%、93.29%。提示采用条件培养基全骨髓培养、免疫磁珠分选的方法可得到高纯度细胞。本研究还显示，分选后细胞表达CD133、CD34、VE-cadherin等特异性表面标志，具有EPCs的形态特征，且能吞噬Dil-ac-LDL并结合UEA-1。证明经上述方法分离培养得到的细胞确为EPCs。

综上所述，成人骨髓来源的EPCs经体外培养后形态、增殖率、生存能力、表面标志表达、功能等方面稳定，可作为心血管组织工程种子细胞或用于干细胞治疗。

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