海南红树林真菌WC1018的鉴定及免疫活性研究

牛莉娜，杨 婧，汪 洋，裴 华，饶朗毓，林英姿

(海南医学院热带医学与检验医学院，海口571101)

红树林真菌是木本植物群落红树林中一个很重要的生态类别，其数量巨大，为最大的海洋真菌生态亚组［1］。海南省为两个国内最大的红树林保护区之一，分布着数量极其庞大、种类繁多的微生物［2］。2010年10月，我们从海南省文昌市清澜港红树林土壤样品中分离到一株真菌WC1018，现将其鉴定情况及免疫活性测定结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 自海南省文昌市清澜港红树林区表层土下5～20cm土壤分离得到的菌株WC1018;海水马丁氏培养基(培养基中添加链霉素、青霉素各100 U/ml)，查氏琼脂(CA)培养基，基础发酵培养基，含10%FBS的RPMI1640培养基;健康成人EDTA-K2抗凝静脉血液2 ml。

1.2 菌株WC1018的鉴定

1.2.1 形态学观察 ①菌落形态特征:采用固体平板培养法。将菌株WC1018采用点接种法转接于CA平板上，置28℃培养箱中培养，肉眼观察菌落直径、菌丝颜色、菌落质地、菌落边缘、菌落背面培养基颜色、培养基扭曲状态、有无渗出液产生及孢子大小、形状、类型、颜色。②显微形态特征:采用插片培养法［3］。将已消毒好的盖玻片以45°角插入培养基中，用接种环将菌株接种于盖玻片与培养基相接的沿线处，置28℃培养箱中培养，每3 d取片一次，采用光学显微镜观察菌株显微结构。

1.2.2 分子生物学鉴定 采用裂解法提取菌株WC1018总DNA，选用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1序列为5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和 ITS4序列为 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，分别扩增ITS和5.8 SrDNA。反应体积 25 μl，包括 10 × PCR buffer 2.5 μl、25 mM dNTP 3 μl、2 μM primer 2.5 μl、Template 0.5 μl、Taq DNApolymerase 2 U，dd H2O 13.6 μl。扩增程序:95℃预变性3min;94℃变性30 s，60℃退火60 s，72℃延伸1min，共35个循环;72℃延伸8min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶，TAE为电泳缓冲液，上样4 μl，80 V电压电泳检测1 h。菌株WC1024的扩增产物直接送大连宝生物工程有限公司纯化后测序:采用www.ebi.ac.uk生物信息网站上的Clustal W软件对供试菌株序列进行分析，邻近—连接法聚类生成系统聚类树，用Bootstrap软件对系统发育树进行检验，并与 GenBank中核酸数据进行比对(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)。

1.3 菌株WC1018免疫活性测定 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法。在96孔细胞培养板内每孔中加入人外周血单个核细胞1×105个，在待测样本孔中加入经RPMI1640培养液10-2稀释的过滤后菌株WC1018发酵上清液，阳性对照孔内加入含5mg/ml植物血凝素(PHA)的基础培养液100 ml，阴性对照孔内加入基础培养液100 ml，每个样本3个复孔。37℃、5%CO2培养72 h，加入含5mg/ml的MTT基础培养液20 ml，37℃、5%CO2培养。4 h后弃培养上清，每孔中加入100 ml DMSO，振荡器震摇10min，酶联免疫检测仪于490 nm波长测定细胞增殖活性(OD值)。实验重复3次。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学处理。计量数据采用±s表示，行单因素方差(One-way ANOVA)分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 菌株WC1018鉴定情况

2.1.1 菌落形态和显微形态特征 根据菌落形态和显微形态特征该菌株初步鉴定为曲霉属(Aspergillus)。①菌落形态特征:菌株在28℃下于CA上生长旺盛，3 d左右可见菌落生长，初为扁平、墨绿色菌落，生长速度快，7、14 d菌落直径分别约19、36 mm。菌落不平，较厚，质地丝绒状，中央凹陷、黄褐色，呈辐射环向外生长，近边缘呈墨绿色，外缘呈白色绒状突起，背面颜色为黄褐色，无气味。培养12 d后有少量紫红色渗出液产生。37℃不生长。②显微形态特征:菌丝无色，有横隔;分生孢子头呈疏松辐射状，大小为100～120 μm。分生孢子梗光滑无色，无横隔，直径8～12 μm;孢子梗顶端膨大形成半球形的顶囊，上半部着生双层小梗，梗基5.5～7 μm×2～3 μm，小梗 5～7 μm ×2～2.5 μm，分生孢子球形，粗糙，直径2.5～3 μm。

2.1.2 分子生物学特征 测序获得菌株WC1018 5.8SrDNA及ITS序列长度为545 bp。Neighbour-Joining构建的系统发育树上与菌株WC1018同源性较高的序列均为曲霉属，其中与杂色曲霉(Aspergillus versicolor)菌株LTBF 011-1的5.8SrDNA及ITS序列同源性最高，相似率及Bootstrap支持率均为100%。

2.2 菌株WC1018免疫活性 菌株WC1018与对照菌株处理后细胞增殖活性见表1。

表1 菌株WC1018与对照菌株处理后细胞增殖活性比较(OD 值，±s)

表1 菌株WC1018与对照菌株处理后细胞增殖活性比较(OD 值，±s)

注:与阴性对照比较，*P＜0.05

菌株 第1次 第2次 第3次WC1018 0.437±0.028* 0.458±0.013* 0.465±0.031*阳性对照 0.423±0.022* 0.462±0.037* 0.476±0.028*阴性对照0.261±0.031 0.273±0.020 0.259±0.041

3 讨论

目前，绝大多数海洋真菌代谢产物来自子囊菌及其无性型菌。常见的产生新型次生代谢物的真菌为曲霉属、青霉属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)、拟青霉属(Paecilomyces)等。高昊等从海南文昌红树林分离到一株泡盛曲霉，发现其具有合成细胞毒活性及新型多羟基甾醇脂肪酸酯结构化合物的能力［4］;崔海滨等从海南文昌红树林筛选到一株真菌，从其发酵液提取物中分离到两种抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的化合物［5］。由于真菌的表型特征较为复杂，仅使用传统的形态学观察方法往往很难将一个菌株准确鉴定到种，也很难弄清其与近缘种之间的生物系统学关系。近年来，利用5.8SrDNA及ITS序列分析进行真核生物系统发育、分类鉴定和多样性研究已经成为有效而快速的方法［6～8］。

本研究显示，WC1018的菌落形态和显微形态特征与曲霉属相似;Neighbour-Joining构建的系统发育树上与菌株WC1018同源性较高的序列均为曲霉属，其中与杂色曲霉菌株LTBF 011-1的5.8SrDNA及ITS序列同源性最高，相似率及Bootstrap支持率均为100%。故根据中国真菌志(第一版)第5卷曲霉属及其相关有性型的分类观点，菌株WC1018归属于半知菌亚门，丝孢菌纲，丝孢菌目，丛梗孢科，曲霉属，巢状亚属杂色组，杂色曲霉;与海南文昌红树林土壤中真菌优势类群及海洋真菌产生新结构物质的优势菌均一致［9］。有关杂色曲霉的免疫增强作用罕见报道。本研究显示，WC1018发酵液处理后细胞增殖活性显著强于阴性对照。提示菌株WC1018可能有较强的免疫增强效果。

综上所述，自海南省文昌市清澜港红树林土壤样品中分离到的菌株WC1018为具有显著免疫增强活性的杂色曲霉。

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