EV71 VP1黏膜疫苗制备及其诱导黏膜免疫的实验研究

李志会，岳盈盈，李 鹏，宋楠楠，孟 红

(山东省医学科学院基础医学研究所，山东省罕少见病重点实验室，济南250062)

肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属，是引起婴幼儿手足口病(HFMD)的主要病原［1，2］，目前对其感染尚无有效治疗药物及疫苗。研究表明，EV71衣壳蛋白VP1能抵抗人类胃液中胃酸破坏，为口服亚单位疫苗预防EV71感染潜在的有效抗原，对防控 EV71流行具有重要价值。2010年8月，我们通过表面展示EV71 VP1蛋白的重组枯草芽孢杆菌制备EV71 VP1黏膜疫苗，并观察了其对小鼠体内IgA抗体的影响，旨在探讨该疫苗的可行性及应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 表面展示EV71 VP1蛋白的重组枯草芽孢杆菌，VP1基因工程蛋白(本实验室构建表达并纯化)［3］，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgAα链，BALB/c小鼠，酶标板。

1.2 实验方法 ①EV71 VP1黏膜疫苗制备:将重组枯草芽孢杆菌接种于氯霉素抗性LB培养基上，摇床37℃、250 r/min培养3 d，其后将菌液于4℃静置2 d使芽孢充分生成，10 000 g离心5min收集菌体，用溶菌酶(20 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0，溶菌酶1 g/L)处理菌体(37℃)1 h，用PBS洗芽孢3次;另取野生型同基因株枯草芽孢杆菌做相同处理。②小鼠免疫:将32只BALB/c小鼠随机分为观察组和对照组各16只，分别接种上述重组枯草芽孢杆菌及野生型同基因株枯草芽孢杆菌制备的EV71 VP1疫苗，灌胃1.7×1010孢子/次 +滴鼻1.0×1010孢子/次，每周2次，共持续4周。③标本收集:取两组免疫后小鼠以乙醚麻醉、眼动脉丛取血，收集血清于-80℃保存待用;脱臼处死小鼠，开胸将肺和心脏完整取出，自气管断端以1 ml PBS冲洗肺泡，离心冲洗液，收集上清，-80℃保存待用;开腹游离小肠，取出贲门端至回盲部末端全小肠，1 ml PBS冲洗小肠，离心冲洗液，收集上清，-80℃保存待用。④EV71 VP1特异性 IgA抗体检测:采用ELISA方法检测两组血清、肺泡及肠组织冲洗液(肺黏膜及肠黏膜)中EV71 VP1特异性IgA抗体水平。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行统计学处理。计量数据以±s表示，行t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

枯草芽孢杆菌经长时间培养、4℃静置及溶菌酶处理后均以芽孢形式存在，证实疫苗制备成功。两组血清、肺黏膜及肠黏膜中EV71 VP1特异性IgA抗体水平见表1。

表1 两组EV71 VP1特异性IgA抗体水平比较(n=16，±s)

表1 两组EV71 VP1特异性IgA抗体水平比较(n=16，±s)

注:与对照组比较，*P＜0.01

组别 血清 肺黏膜 肠黏膜观察组 0.407±0.056* 0.234±0.036*0.150±0.022对照组0.201±0.076 0.137±0.012 0.140±0.052

3 讨论

EV71通过黏膜入侵机体而致病，故黏膜途径疫苗对控治其感染具有重要意义。研究发现，机体存在局部和共同黏膜免疫系统，通过分泌具有高亲和力中和毒素及病原微生物能力的特异IgA抗体发挥作用;口服疫苗对疟疾、日本脑炎等非黏膜途径感染的病原也具有良好保护作用［4］;鼻黏膜组织能初步激活局部及全身幼稚抗原特异性的CD4+及CD8+T细胞［5］。故通过适当黏膜途径进行免疫可同时有效诱导局部黏膜免疫应答和全身系统免疫应答，且诱导局部产生黏膜相关IgA抗体的保护效应比仅诱导产生血清抗体的效果更好［4］。

芽孢用于制备疫苗的研究始于19世纪80年代。Ducle等［6］对枯草芽孢杆菌芽孢的免疫特性以及在细胞内的归宿研究显示，芽孢可诱导机体产生局部免疫和系统免疫反应，抗体类型主要为IgG、IgA和IgM，其中鼻腔免疫后抗体主要为IgG1、IgG2b和IgM。Mauriello等［7］用CotC为融合表达载体蛋白展示了破伤风毒素C片段(TTFC)及大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)，其黏膜免疫小鼠亦可诱导产生全身及黏膜特异性抗体;口服免疫后的小鼠可抵抗致死剂量破伤风毒素攻击［8］。大量研究充分表明，枯草芽孢杆菌芽孢是黏膜免疫的有效载体，且芽孢表面展示抗原比芽孢萌发时展示的抗原诱导能力更加有效［9］。本研究显示，EV71 VP1黏膜疫苗成功制备，观察组血清及肺黏膜中VP1特异性IgA抗体水平显著高于对照组，但两组肠黏膜中抗体水平无显著差异。表明该疫苗能有效刺激机体产生特异性黏膜免疫反应，但在诱导肠道黏膜免疫反应中仍有不足。可能机制:①小鼠肠道系统存在大量正常菌群，易产生免疫耐受;②鼻黏膜组织渗透性较高、酶活性低、免疫细胞众多，刺激呼吸道黏膜免疫直接有效;③芽胞表面展示的抗原自身特性对诱导机体免疫反应具有重要作用［10］。

综上所述，展示EV71结构蛋白VP1的枯草芽孢杆菌芽孢可成功制备疫苗，且能有效刺激机体产生特异性黏膜免疫反应;此为EV71疫苗的研制提供了新思路。

［1］Chan KP，Goh KT，Chong CY，et al.Epidemic hand，foot and mouth disease caused by human enterovirus 71，Singapore［J］.Emerc Infect Dis，2003，9(1):78-85.

［2］Wang JR，Tuan YC，Tsai HP，et al.Change of major genotype of enterovirus 71 in outbreaks of hand-foot-and-mouth disease in Taiwan between 1998 and 2000［J］.J Clin Microbiol，2002，40(1):10-15.

［3］岳盈盈，李志会，李鹏，等.肠道病毒71型结构蛋白VP1的原核表达及初步鉴定［J］.山东医药，2011，51(7):22-24.

［4］Ogra PL，Faden H，Welliver RC.Vaccination strategies for mucosal immune responses［J］.Clin Microbiol Rev，2001，14(2):430-445.

［5］Ceragioli M，Cangiano G，Esin S，et al.Phagocytosis，germination and killing of Bacillus subtilis spores presenting heterologous antigens in human macrophages.［J］.Microbiology，2009，155(Pt 2):338-346.

［6］Ducle H，Hong HA，Uyen NQ，et al.Intracellular fate and immunogenicity of B.subtilis spores［J］.Vaccine，2004，22(15-16):1873-1885.

［7］Mauriello EM，Ducle H，Isticato R，et al.Display of heterologous antigens on the Bacillus subtilis spore coat using CotC as a fusion partner［J］.Vaccine，2004，22(9-10):1177-1187.

［8］Ducle H，Hong HA，Fairweather N，et al.Bacterial spores as vaccine vehicles［J］.Infect Immun，2003，71(5):2810-2818.

［9］Uyen NQ，Hong HA，Cutting SM.Enhanced immunisation and expression strategies using bacterial spores as heat-stable vaccine delivery vehicles［J］.Vaccine，2007，25(2):356-365.

［10］Lee S，Belitsky BR，Brinker JP，et al.Development of a Bacillus subtilis-based rotavirus vaccine［J］.Clin Vaccine Immunol，2010，17(11):1647-1655.