瘦肉精的毒害作用及其试纸快速检测技术

张改平 ，王选年 ，2，肖 肖

（1.农业部动物免疫学重点开放实验室，河南省动物免疫学重点实验室，河南省农业科学院，河南 郑州 450003；2.新乡学院生物技术研究中心，河南 新乡 453003；3.中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032）

“瘦肉精”泛指一类具有相似结构的β-肾上腺素受体激动剂（简称β-激动剂，β-Adrenergic agonists）化合物。由于其能够调节支气管扩张和平滑肌松弛，在临床上常被用做平喘药物，治疗呼吸系统疾病。当摄入量较大时对心血管系统和神经系统具有刺激作用[1]，引起心悸、心慌、恶心、呕吐、肌肉颤抖等临床症状。摄入量过大，还会危及生命。

自20世纪80年代早期，美国Cyanamid公司的实验证明饲喂β-激动剂—盐酸克伦特罗能够调节动物的生长[2]。在肉用动物生产中，当其应用剂量达治疗量的5～10倍时具有能量重分配（repartitioning）作用，能促进肌肉发育和脂肪分解，提高胴体瘦肉比率，促进动物生长，降低饲养成本。但此类物质会在动物组织中残留，尤以肝脏等内脏器官残留较高，当人们食用了含“瘦肉精”残留的动物内脏和肉品后，常造成急性或慢性食肉中毒，危害消费者的健康安全。到目前为止没有一个国家批准β-激动剂类药物用于动物生产之中，但长期以来一直存在着非法使用，并造成严重的食物中毒事件[3-8]。因此，在肉用动物中应用“瘦肉精”一直是人们关注的焦点问题。

1 “瘦肉精”的分类及其能量重分配作用

作为“瘦肉精”使用的β-激动剂主要有两种类型。一种是苯乙醇胺类，如盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CL）和沙丁胺醇（salbutamol）等，另一种是双苯烷胺类，如莱克多巴胺（Ractopamine）等。口服CL对牛、鸡、猪和绵羊等动物都具有增加胴体肌肉组成和减少脂肪含量的作用，对增加体重和提高料肉比也有一定作用（表1）[1-2]。从表1可见，不同动物品种对β-激动剂的反应性不同。其中对绵羊的促生长作用最大，对鸡的作用最小，对牛、猪的作用中等。这可能是由于不同动物对β-激动剂的反应性不同，也可能与动物的生长潜力有关。

表1 β-激动剂对畜禽生长作用的影响

2 “瘦肉精”的非法使用及中毒事件

盐酸克伦特罗残留引起的中毒事件最早发生在西班牙，1989年10月至1990年7月间暴发因食用牛肝引起135人中毒[3]，这次中毒事件发生于食用牛肝后的30 min至6 h，最长持续至40 h，共有43个家庭中91%的成员受到影响。在食用的牛肝中发现CL含量达160～291μg/kg。1992年1月至4月又在该国北部地区暴发232例中毒病例[9]。从屠宰场获得的牛肝样品中CL含量为19～5395μg/kg。病人尿液中CL 含量为 11～486μg/L。

1990年秋季，在法国共有8个家庭22人发生CL中毒[5]，中毒症状表现在食用牛肝后的1～3 h，发病1～3 d后全部恢复。食用牛肝中CL含量达375～500μg/kg。在这些中毒事件中大多数病人中毒症状都表现为心悸、肌肉震颤、肌肉疼痛、神经症状、头晕头痛、兴奋、恶心呕吐、发热寒战等。中毒的发生无年龄（1～68岁）和性别差异。

我国香港、上海、北京、浙江、广东、山东、河北、广西、黑龙江和安徽等地均有“瘦肉精”中毒事件报道，2001年国家严格管控盐酸克伦特罗以来，莱克多巴胺、沙丁胺醇等“新型瘦肉精”使用呈上升趋势。但盐酸克伦特罗价格便宜，且毒性最大，世界范围内的中毒事件基本都是以盐酸克伦特罗为祸首。

1997年5月，17名香港居民因食用残留有CL的猪内脏而出现手指震颤、头晕、心悸、口干、失眠等症状[10]，成为我国第一起“瘦肉精”中毒案例。随后各地中毒事件时有发生，最严重的中毒事件发生在2001年，据不完全统计，2001年我国大陆地区发生CL食肉中毒事件多达1600多人次[11]。最近的中毒事件发生在广州和深圳，分别是2009年广州市70人中毒事件和2010年深圳市13人中毒事件。

CL用于治疗人的呼吸系统疾病，其支气管扩张剂量大约为 1μg/人（约 0.02μg/kg 体重），经统计学证明（P<0.05），用于支气管扩张的有效剂量为5～25μg/人[12]。在欧美一些国家用于人的治疗剂量为20～30μg，2 次 /d（约 0.3～0.5μg/kg 体重）。我国药典规定CL 用于人的治疗剂量为口服 20～40μg/d，3次 /d[13]。CL的主要禁忌症包括心脏病、糖尿病、高血压、青光眼、甲亢、前列腺肥大等，主要副作用有心悸、震颤、头晕、头痛等症状[13-14]。出现这些症状的原因主要是因为在支气管、心脏、神经系统的细胞表面分布有大量β2 受体[15]。

通过发生于西班牙、法国、香港及我国大陆的中毒事例分析，安全评价CL的药理活性必须根据中毒剂量和药物的药理活性确定消费者所能接受的药物食用残留。按食用100 g含CL160～500μg/kg的肝脏计算，其所接受到的CL剂量即已达到5μg/kg，足以引起药理效应[16]。因此一直以来，全世界没有任何国家批准CL作为饲料添加剂用于肉用动物及表演宠物。国际奥委会也将CL列入被查的兴奋剂名单，禁止运动员非法使用。为了保证消费者的食用安全，FDA和WHO规定了CL在动物体内的最高残留限量为：肉 0.2μg/kg（ppb），肝 0.6μg/kg，肾 0.6μg/kg，脂肪 0.2μg/kg，奶 0.05μg/kg。我国农业部也规定了CL 的残留标准[17]，马、牛肌肉 0.1μg/kg，肝、肾 0.5μg/kg，牛奶 0.05μg/kg。

3 我国政府对“瘦肉精”非法使用的综合治理

1997年3月25日，我国农业部发布了《关于严禁非法使用兽药的通知》，严禁将β-肾上腺激动剂等药物作为动物促生长剂使用[18]。

1997年9月4日，农业部发布《动物性食品中兽药最高残留限量》，规定CL在马、牛肌肉、肝脏、肾脏及牛奶中的最高残留限量（Maximum Residue Limit，MRL）分别为 0.1、0.5、0.5 和 0.05μg/kg，日允许摄取量（AcceptableDailyIntake，ADI）为 0～0.004μg/kg/d[17]。

由于香港特区政府卫生署1998年5月14日公告在内地供港的活猪内脏中查出含有违禁药物的残留成分—盐酸克伦特罗。为保证食品卫生安全，特区政府卫生署已做出禁止在市场上销售内脏的决定。为确保供港活猪的卫生质量，1998年6月19日，对外贸易经济合作部、农业部、国家出入境检验检疫局联合下发《关于严禁非法使用兽药和加强检疫工作等有关事项的通知》[19]。

1999年5月11日，农业部发布《中华人民共和国动物及动物源食品中残留物质监控计划》和《官方取样程序》[20-21]。2000年4月3日，农业部、国家药品监督管理局联合发布《关于查处非法生产、销售和使用盐酸克伦特罗等药品的紧急通知》[22]。

2001年2月15日，农业部发出《关于发布饲料中盐酸克伦特罗的测定等5项行业标准的通知》[23]，公布了《饲料中盐酸克伦特罗的测定》行业标准[24]，制定了饲料中盐酸克伦特罗的检测方法，指定高效液相色谱仪（HPLC）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）法为确证法（仲裁法），适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中盐酸克伦特罗的测定与确证。HPLC的最低检测浓度为50μg/kg，GC-MS法最低检测浓度为10μg/kg。

2001年6月13日，农业部、国家经济贸易委员会、国家工商行政管理总局、国家质量监督检验检疫总局、国家药品监督管理局5部委联合发文，严厉打击非法生产经营和使用盐酸克伦特罗等药品违法行为[25]。2001年9月3日，农业部颁布《动物组织中盐酸克伦特罗的测定气相色谱-质谱法》行业标准[26]，规定了以气相色谱-质谱（GC-MS）法测定动物组织中盐酸克伦特罗残留的方法。适用于动物肝脏组织中盐酸克伦特罗的测定，最低检出限为2μg/kg。

2001年10月，农业部颁布《猪尿液中克伦特罗检测方法—酶联免疫吸附测定法》[27]，制定了猪尿液克伦特罗检验的制样和酶联免疫吸附测定行业标准，适用于猪尿液克伦特罗残留快速筛检，若检测结果小于1.0μg/L时可判为未检出，大于1.0μg/L时判为可疑，需用确证法确证。

2001年11月29日，国务院重新修订并颁布《饲料和添加剂管理条例》[28]，为加强对饲料、饲料添加剂的管理，提高饲料及添加剂的质量，促进饲料工业和养殖业的发展，维护人民身体健康提供了有力的法律武器。

为保证动物源性食品安全，维护人民身体健康，2002年4月15日，农业部根据《兽药管理条例》规定，制定了《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》[29]。清单规定了β-兴奋剂类，克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗及其盐、酯及制剂禁止应用于所有食品动物的所有用途。

2003年12月16日，为加强饲料、兽药和人用药品管理，防止在饲料生产、经营、使用和动物饮用水中超范围、超剂量使用兽药和饲料添加剂，杜绝滥用违禁药品的行为，根据《饲料和饲料添加剂管理条例》、《兽药管理条例》和《药品管理法》规定，农业部、卫生部、国家药品监督管理局联合发布公告，公布了5类40种药物禁止在饲料和动物饮用水中使用，其中第一类为7种肾上腺素受体激动剂，分别是盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、莱克多巴胺、盐酸多巴胺、西马特罗、硫酸特布他林[30]。生产、销售、经营、使用禁用清单中的药品，用于饲料生产和饲养过程中的，依据法律法规予以处罚；构成犯罪的，要移送司法机关，依法追究刑事责任。

为加强饲料及养殖环节质量安全监管，保障饲料及畜产品质量安全，2010年12月27日，农业部根据《饲料和饲料添加剂管理条例》有关规定，颁布第1519号公告[31]，禁止在饲料和动物饮水中使用苯乙醇胺等11种物质，其中苯乙醇胺A、班布特罗、盐酸齐帕特罗、盐酸氯丙那林、马布特罗、西布特罗、溴布特罗、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗等9种为肾上腺素受体激动剂。要求各级畜牧饲料管理部门加强日常监管和监督检测，严肃查处在饲料生产、经营、使用和动物饮水中违禁添加苯乙醇胺等物质的违法行为。

我国政府在加强法律法规建设的同时，非常重视饲料生产及动物饲养各环节非法使用违禁药物的查处工作。在治理“瘦肉精”非法使用上，要求各级有关职能部门提高认识，联合行动，完善监测手段，认真贯彻国家法律法规，从“瘦肉精”的生产、销售、经营、使用以及从生猪的饲养、收购、屠宰加工各个环节加强执法力度，确保人民身体健康。

4 “瘦肉精”的毒害作用

当人们食用了含CL残留的动物内脏和肉品后，常造成急性或慢性食肉中毒，出现心悸、心慌、恶心、呕吐、肌肉颤抖等临床症状。一般情况下，盐酸克伦特罗对于人体的危害主要是由于它在动物肝脏、肾脏、肌肉等组织器官中的残留所引起。消费者过量食用后，容易产生心血管毒性，表现为恶心、头晕、心率过快、肌肉震颤、高血糖、低血钾等症状，尤其对心血管疾病患者危害更大。

我们在研究CL快速检测实验期间屡次观察到应用CL抗原免疫的家兔发生全身瘫痪、偏瘫等中毒症状，最终导致家兔消瘦死亡[11]（图1-A）。人们食用CL残留的肉食品是否会发生类似症状应当引起关注。

实验动物（大白鼠）应用CL 2 mg/kg·d拌料连用2～5周，18～25%出现心肌肥大[32]。笔者对小鼠应用5 mg/kg CL腹腔注射连用7周后，在每次用药后10分钟内小鼠即出现全身颤抖、行走不稳，继而出现精神沉郁症状。心脏的病理学变化表现为心肌变性，横纹消失，淋巴细胞浸润，严重者出现心肌纤维蜡样坏死等变化（图 1-B，C，D）[11]。

运动员中应用CL 400～1575μg/kg，连用2～6周，除颤抖和神经症状以外还出现左心室肌肉肥大，心动过速，射血分数下降，心肌纤维化，心电图ST异常，心肌酶CPK和CK-MB升高，肾硬化衰竭[33-34]，甚至死亡[12]。

克伦特罗具有热稳定性[3，35]，一般烹调方法（100℃）不能破坏其生物活性，油炸（260℃）5 min其活性损失50%。因此，监测肉品中CL的残留含量具有重要的意义。

据报道，肉品中的克伦特罗含量超过100μg/kg时就有可能引起食用者的急性中毒[36]。据香港2001年的研究显示[37]，肉品中较低的CL含量即能够引起食用者发生中毒反应。中毒剂量范围是，猪肉中残留达 20～460μg/kg，猪肝中达 19～3060μg/kg。

由于在肉用动物中非法使用CL能够引起食用者的中毒反应，同时CL对实验动物和人类的心脏功能也有严重的影响，CL在治疗疾病时也有严重的副作用，综合治理CL非法使用刻不容缓。

5 “瘦肉精”检测技术

对“瘦肉精”监管和治理的最有效方法是健全法律、法规以及提高法律意识，严厉禁止“瘦肉精”在食品动物中的应用。精确、快速的检测方法是确保这些政策法规有效实施的有力武器。

5.1 “瘦肉精”检测技术分类

根据检测原理，“瘦肉精”的检测技术主要有确证分析技术和快速筛查技术等。确证分析技术以色谱技术为主，是检测“瘦肉精”的经典技术，主要有薄层层析（TLC）、高压液相色谱（HPLC）、高压液相色谱/二极管陈列（HPLC/PDA）、高压液相色谱 /荧光（HPLC/FLU）、液相色谱 -质谱联用（LC-MS）[38]、气相色谱-质谱联用（GC-MS）[39]、气相色谱-傅立叶红外联用（GC-FTIP）和毛细管电泳等方法。这些方法灵敏、准确，常作为瘦肉精残留检测的确证方法。如欧盟、美国等国家将GC-MS法作为确证法用于CL检测。我国农业部也颁布了饲料中CL测定的限制性标准[24]，规定HPLC和GC/MS为CL的“确证法”（仲裁法）。虽然这些方法具有灵敏、准确的特点，但样品处理繁琐费时，成本高，而且需要有经过专门训练的专业人员来操作复杂的仪器设备，因此限制了其广泛应用。

快速筛查技术通常以免疫学分析方法为原理，采用胶体金免疫层析技术和酶联免疫技术，产品包括快速试纸检测卡和试剂盒，可用于“瘦肉精”定性或半定量检测，检测限一般在十亿分之一的数量级（ng级）。其特点是成本较低，使用便捷，但一般每种试剂卡或试剂盒只能检测一种药物，而且其检测结果中有假阳性，必须通过仪器确证后才能作为执法依据。

快速筛查技术具有敏感、特异、快速且一次能检测大量样品的特点，检测精度可达ng/g级。主要有放射免疫技术（RIA），酶免疫技术（EIA），免疫生物传感器技术，时间分辨荧光免疫分析技术以及试纸条检测技术等[40-41]。这些技术已被国际上许多实验室应用HPLC、GC-MS等色谱技术确证，目前欧盟、美国等许多检测机构都将其列为主要的“筛选法”，用于CL非法使用的检测。

酶免疫技术（EIA）的工作原理为竞争性抗原抗体结合反应。在反应系统中被检样品中CL与酶标记CL共同竞争酶标板上的CL抗体位点，反应达到平衡后，洗去未结合的CL及酶标CL，用相应的酶底物显色，根据样品孔与标准孔的颜色对照判定结果。用于EIA的CL抗体有多克隆抗体和单克隆抗体之分，应用多抗存在不同β-兴奋剂的交叉反应性，应用单抗则大大提高其反应特异性。

5.2 “瘦肉精”快速检测试纸技术设计与原理

河南省农科院动物免疫学重点实验室（农业部动物免疫学重点开放实验室）与河南百奥生物工程有限公司于2001年在国内外率先研发成功了“瘦肉精”专用快速检测试纸技术并投放市场，该技术拥有自主知识产权，并获得了国家发明专利。使用该试纸可在60秒内快速直观地检测出肉品中是否含有超过安全标准的“瘦肉精”。该试纸检测技术以单克隆抗体为基础设计而成。检测时，胶体金标记的“瘦肉精”单抗被检测线上固定化的“瘦肉精”人工结合抗原（如BSA-CL）捕获，形成一条棕红色的检测线，此时过量的胶体金标记单抗继续涌动被对照线上固定化的羊抗鼠抗体捕获形成一条棕红色的对照线。如果样品中含有“瘦肉精”，它将与固定化在检测线上的人工抗原竞争有限的胶体金标记单抗，样品中“瘦肉精”含量越多则检测线形成的颜色越浅（图2，图3）。该检测方法可根据用户需要进行目视定性检测、半定量检测，也可进行精确定量测定。

5.3 “瘦肉精”快速检测试纸的定性和半定量检测

定性检测时，根据检测线与对照线的有无和颜色的深浅进行判定。显色区出现检测线（T线）和对照线（C线）两条线，且T线颜色明显浅于C线颜色；或者显色区只出现一条C线，而T线不显色，判为阳性（图4-1）。显色区出现检测线（T线）和对照线（C线）两条线，且T线颜色不浅于C线颜色，判为阴性（图4-2）。显色区两条线（T线和C线）均不出现，表明操作有误或试纸条失效，判为无效（图4-3）。

半定量测定时，根据样品检测线显示颜色与系列标准品的检测线颜色相比较，颜色越浅则样品中盐酸克伦特罗含量越高：反应线颜色浅于哪个标准品的检测线颜色，即表示该样品中盐酸克伦特罗浓度大于此标准孔的浓度；样品检测线显示颜色深于哪个标准品颜色，则表示该样品中盐酸克伦特罗浓度小于此标准浓度；样品检测线颜色介于两个标准品颜色之间时，则样品中盐酸克伦特罗浓度也介于这两个标准浓度之间。定量测定时，以各标准品吸光值与0标准品吸光值之比（B/Bo）为纵坐标，以标准品浓度的对数为横坐标在半对数坐标纸上画出标准曲线，根据样品的吸光值在坐标纸上找出其对应的样品浓度，或者计算出回归方程，求出样品浓度。其最低检测限为0.5 ng/mL，具有敏感性高、特异性强，检出范围广（在0.5～128 ng/mL范围内线性关系良好，R2＝0.996），样品处理简单，回收率高，成本低等特点。

5.4 “瘦肉精”快速检测试纸的定量检测

定量检测时，应用试纸条检测浓度在一定范围的系列“瘦肉精”标准品的检测结果，用试纸条光密度阅读仪扫描检测线的相对光密度值（ROD），以检测线的ROD与标准品浓度的对数作标准曲线，计算回归方程。根据检测样品的光密度值计算样品中“瘦肉精”含量。图5显示CL快速检测试纸条检测标准品的光密度扫描曲线和标准曲线，该试纸条在CL浓度0.1～8.1 ng/mL时线性关系良好，检测猪尿液中CL的半数抑制浓度（IC50）可达1.78 ng/mL[40]。

目前，“瘦肉精”禁用目录中的药物基本上都有确证检测技术，准确度都很高，但成本也较高，耗费时间也很长，而且只能由具有法定资质的专业机构检测才能作为执法依据。因此，一般情况下，我们首选快速筛查，对筛查中呈阳性的样品作进一步的确证分析。

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