猪链球菌2型分离株的生物学特性试验

刘丽蓉 ，常 凯 ，吴 娟 ，单 虎

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109；2.泉州出入境检验检疫局，福建 泉州 362000）

猪链球菌2型感染可引起猪脑膜脑炎、心内膜炎、多发性关节炎等疾病，可感染人并致死，是一种重要的人兽共患病病原菌[1-2]，在全国范围内都是优势流行株。2005年6-7月发生在四川省资阳、内江等地区的2型猪链球菌感染事件造成了极大的经济损失，引起社会广泛关注[3]。此外，1型和9型是除2型外的流行株[4-5]，也可使猪发病。近几年来，猪链球菌病的发病呈上升趋势，该病往往发病急，死亡快，给养殖业带来了重大的经济损失。同时也给公共卫生安全带来的重大的隐患。虽然理论上有很多药物能治疗猪链球菌病，但随着抗菌药物的广泛使用以及临床中不合理用药，使得病原菌的耐药现象日趋严重[6-8]。本试验对从发病猪肺、肝、脾和淋巴结中分离到的链球菌株进行生化试验、药敏试验及致病性试验等研究，确定为猪链球菌2型，为预防和控制该病的流行提供了重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 猪链球菌2型参考菌株（HA9801）由中国动物卫生与流行病学中心提供；病原菌株由济南某屠宰场和急性死亡病例猪猪场提供。

1.1.2 实验动物 小鼠，购于青岛市药品检验所。

1.1.3 主要试剂 THB液体培养基为北京陆桥有限公司产品；微量生化发酵管为杭州天和微生物试剂有限公司产品；药敏纸片为北京天坛药物生物技术开发公司产品。

1.1.4 参照倪秀艳等[9]，针对CPS 2J基因片段设计合成引物对：

P1：5’-CAAACGCAAGGAATTACGGTATC-3’

P2：5’-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’

由北京赛百盛生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离

无菌条件下，采集病猪心血、肺、肝、脾和淋巴结、扁桃体划线接种于绵羊血平板，37℃培养18～24 h，挑取α溶血、光滑圆形、针尖状大小的可疑菌落接种到THB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。

1.2.2 培养特性鉴定及形态观察

分离菌株分别接种于绵羊血平板及THB液体培养基中，置37℃培养16～18 h，观察其培养特性。用接种环取血平板单菌落作革兰氏染色，在油镜下进行形态观察。

1.2.3 生化特性

将分离得到病原菌接种于乳糖、蔗糖、蕈糖、葡萄糖、七叶苷、山梨糖、山梨醇、甘露醇、尿素、水杨苷、棉子糖、阿拉伯糖、甘油、VP、6.5%高盐肉汤和pH 9.6肉汤中。放置于37℃恒温箱培养中培养24 h后，观察并记录结果。重复全部试验3次，列出重复性良好的菌株的生化特性。符合链球菌生化指标的菌株判为链球菌。

1.2.4 PCR鉴定

1.2.4.1 模板的制备

按照煮沸法制备，吸取培养好的1 mL菌液于1.5 mL EP管里，10000 r/min离心2 min，弃去上清。加入250μL双蒸水吹打均匀后煮沸 5 min，10000 r/min离心1 min，移上清液至另一EP管里，-20℃保存备用。

1.2.4.2 PCR扩增

PCR扩增反应在PCR仪上进行，在0.5mLPCR反应管中，采用20uL体系，反应程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃1min 35 个循环；72℃10min。

1.2.4.3 PCR产物测序

将得到的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统下观察并拍照。用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物回收，克隆到pMD19-T载体上，送上海生工生物技术有限公司测序。用DNAstar软件对测定的核苷酸序列进行分析，并与Genebank的序列进行同源性比较。

1.2.5 药敏试验

用常规的药敏纸片扩散法进行该项试验。用灭菌后的棉签醮取病原菌密集涂布与绵羊血琼脂平板表面。用经灭菌的镊子将药敏纸片轻轻的放置在培养基的表面，纸片直接的距离为3 cm左右，距离培养皿边缘的距离为1.5 cm左右，然后放置在37℃的培养箱中培养24 h，取出观察抑菌圈的大小。使用的药敏纸片有：复方新诺明、氨苄西林、新霉素、卡那霉素、四环素、恩诺沙星、青霉素、强力霉素、丁胺卡那、庆大霉素、万古霉素、阿莫西林、多黏菌素和链霉素。

1.2.6 动物致病性试验

用分离的链球菌接种THB液体培养基纯培养24 h，将菌液浓度调整为约1.5×109CFU/mL，分别按0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL剂量腹腔接种试验组昆明小鼠，10只/组，对照组注射1.0 mL的THB液体培养基，所用实验小鼠均为25 g左右。对注射链球菌菌液的小白鼠进行隔离饲养，随时观察并记录其发病及死亡情况。对发病死亡的小鼠应及时剖检，无菌采集其肝脏、肺脏及脾脏，涂片，镜检。

2 结果

2.1 细菌的分离

从发病猪场50份病料中分离到猪链球菌2型8株，检出率分别为16.0%，分别命名JNB01、JNB02、JNB03、JNB04、JNB05、JNB06、JNB07 和 JNB08。从屠宰场198份生猪扁桃体样品中分离到猪链球菌2型6株，检出率为3.0%，分别命名JNT01、JNT02、JNT03、JNT04、JNT05 和 JNT06。

2.2 细菌形态及培养特性

分离菌在绵羊血平板上能长出灰白色、圆形、透明湿润、中央隆起、表面光滑、边缘整齐、针尖大小的露滴样小菌落。挑取单个菌落涂片，革兰染色镜检为近乎小杆状的单个、成对或长短不一的链状排列的革兰阳性球菌。THB液体培养基中有白色絮状沉淀，上清浑浊，涂片可见链状排列的革兰阳性球菌，链较固体培养基中的长。

2.3 生化试验

该病原菌可发酵乳糖、蔗糖、蕈糖、葡萄糖和七叶苷，不发酵山梨糖、山梨醇、甘露醇、尿素、水杨苷、棉子糖、阿拉伯糖、甘油、VP、6.5%高盐肉汤和pH9.6肉汤（表 1）。

表1 病原菌的生化特性

2.4 PCR鉴定

2.4.1 猪链球菌2型PCR扩增结果

通过PCR扩增cps2J基因，该菌株能扩增出大小为675 bp的条带（图1）。

2.4.2 PCR产物测序

将克隆产物送上海生工生物技术有限公司测序。经BLAST分析表明，该菌株与Genebank中猪链球菌2型参考菌株的同源性达98%～100%。

2.5 药敏试验

药敏纸片本身直径，抑菌直径是包括药敏纸片在内测量结果。药敏试验的判定依据是：抑菌圈的直径≧15mm为高度敏感，抑菌圈直径在10mm～15mm为中度敏感，抑菌圈≦10mm为不敏感。从表2可看出，该病原菌对复方新诺明、氨苄西林、恩诺沙星、青霉素、万古霉素、阿莫西林高度敏感；对新霉素、卡那霉素、四环素、强力霉素、丁胺卡那、庆大霉素中度敏感；对多黏菌素有耐药性。

表2 病原菌的药敏试验

2.6 动物致病性试验

腹腔接种0.2 mL分离菌的10只小白鼠和对照组均未见异常；接种0.5 mL分离菌的10只小白鼠于感染后36 h出现精神沉郁、被毛松乱症状，但96 h后症状减轻并耐过；而接种1.0 mL分离菌的10只小白鼠于24～48 h全部死亡。剖解均见败血症，心脏、脾脏、肝脏等涂片，革兰氏染色，镜检，均可分离到接种的细菌。

3 讨论

链球菌在绵羊血平板上多呈单个、成对或短链状排列，在液体培养基中多呈长链状，鉴定链球菌难度不大，但要确定其为何种链球菌就比较困难。由于链球菌的生化特性差异较大，仅以形态特征、培养特性、生化特征等难以将分离的菌株准确的分型归类，因此，常结合PCR进行准确鉴定。PCR检测方法已广泛应用于病原微生物的特异、敏感及快速的检测，尤其适用于培养困难或血清学方法难以检测的病原微生物。本试验中参考倪秀艳针对cps2J基因合成的引物能扩增出相应的目的片段，充分表明了PCR方法具有很高的特异性，完全适合于猪链球菌2型的诊断。

由于链球菌广泛存在于正常猪的呼吸道、扁桃体等器官和组织中，猪群链球菌的带菌率与猪群是否发生猪链球病并无直接关系。链球菌是革兰氏阳性菌，理论上很多药物对其有疗效。但近年来由于抗生素的滥用，如在动物饲料中长期添加抗生素用于促进生长及预防和治疗疾病，发生疾病后为经兽医诊断就盲目大量使用多种抗生素，不仅治疗成本提高，而且产生了大量耐药菌株，使疾病难以控制。

对该病原菌的药敏试验结果表明该分离菌株对复方新诺明、氨苄西林、恩诺沙星、青霉素、万古霉素、阿莫西林高度敏感；对新霉素、卡那霉素、四环素、强力霉素、丁胺卡那、庆大霉素中度敏感；对多黏菌素有耐药性。建议猪场在防治猪链球菌病时，对菌株进行药敏试验，根据试验结果用2～3种敏感药物按疗程和适当剂量交替使用。

动物试验是目前区分猪链球菌2型毒力唯一有效的方法。本试验小鼠均于48 h内死亡，表明该分离株为强致病菌株。

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