儿科分离金黄色葡萄球菌耐药性和耐甲氧西林株的流行病学研究

李颖丰,周晖登

金黄色葡萄球菌 (SA)是引起院内和社区感染的常见病原菌之一,由于抗菌药物的广泛应用,耐药菌株迅速增多,耐药谱不断变迁;尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)呈高致病性和多重耐药,且在世界范围流行,这给临床抗感染治疗带来极大困难。随着耐万古霉素 MRSA的不断出现[1-2],MRSA感染的流行已引起高度重视和关注。为了解本地区儿童感染 SA对常用抗菌药物的耐药及 MRSA流行情况,本研究对临床分离 SA儿童株进行耐药模式和 MRSA随机扩增多态 DNA分型 (RAPD)研究,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2007年 1月—2009年 12月在广西壮族自治区妇幼保健院住院患儿送检的痰、血、尿、咽拭子及伤口分泌物等标本中分离的 SA共 348株,质控菌株 SA AT25923购于卫生部临检中心。

1.2 药物敏感试验 采用法国梅里埃 ATB半自动微生物鉴定/药敏分析仪及 GPI药敏卡进行药敏试验,结果判定及质量控制按美国临床实验室标准化委员会 (CLSI)2006版标准[3]进行,以苯唑西林最低抑菌浓度 (MIC)＞4μg/ml为 MRSA。β-内酰胺酶检测采用头孢硝基噻吩显色法进行,纸片变为红色为阳性。

1.3 同源性分析 按试剂盒 (北京赛百盛公司产品)说明书提取 SA染色体 DNA,采用美国 PE公司 5700PCR仪进行扩增,总反应体系为 50μl[10×buffer 5μl,20 mmol/L Mg2+5 μl,10 mmol/L dNTP 1 μl,50 pmol/μl引物 (5-CCG CTA CCGA-3)0.5μl,双蒸水 36.5μl,模板 2μl],扩增条件:94℃预变性 4 min,94℃变性 60 s、42℃复性 60 s、72℃延伸 60 s,35个循环,72℃延伸 5 min。产物经含溴化乙锭(EB)的 1.2%琼脂糖凝胶电泳,根据电泳条带确定型别。

1.4 统计学方法 药敏资料采用 WHONET 5.4软件进行分析。

2 结果

2.1 SA分布率 检出 SA的标本主要来自新生儿科 37.93%(132株),其次为儿科 PICU 27.01%(94株),呼吸科18.97%(66株),儿外科 10.63%(37株),儿内科 5.46%(19株)。各类标本中检出 SA最多的为痰液 42.53%(148株),其次为伤口分泌物 24.14%(84株),血液 13.79%(48株),咽拭子 10.34%(36株),尿液 7.18%(25株),其他2.02%(7株 )。

2.2 SA耐药性总体情况 348株 SA中,334株产 β-内酰胺酶,对青霉素和阿莫西林/棒酸耐药较高,分别为 100.00%和49.14%;对其余 β-内酰胺酶类抗菌药物耐药率较低,为6.03%～12.93%。耐药率较低的有呋喃妥因、利福平、左氧氟沙星和环丙沙星,为 3.74%～16.38%;耐药率较高的有四环素、复方新诺明、克林霉素和大环内酯类,为 43.97%～65.23%;未发现对万古霉素、替考拉林和利奈唑胺耐药株。具体见表1。

表1 348株 SA对常用抗菌药物的耐药性 (%)Table 1 The antibiotic resistance of 348 isolates staphylococcus aureus

2.3 MRSA与 MSSA耐药性比较 348株 SA中检出 MRSA 34株,MRSA、MSSA(甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌)对青霉素耐药率均为 100.00%,对万古霉素、替考拉林、利奈唑胺、呋喃妥因和利福平耐药率均较低,为 0～8.82%,而对其余 17种抗菌药物耐药率 MRSA均高于 MSSA。具体见表1。

2.4 MRSA同源性分析 经 RAPD分型,可见 1～11条基因条带,共分为 6个基因型 (见图1)。其中Ⅰ型 22株,Ⅱ型 5株,Ⅲ型 1株,Ⅳ型 3株,Ⅴ型 2株,Ⅵ型 1株,以Ⅰ型感染为主 (64.71%)。不同 MRSA基因分型的科室分布见表2。

表2 34株 MRSA-RAPD基因分型临床科室分布Table 2 The clinical distribution of RAPD analyses of 34 Methicillin-resistant staphylococcus aureus

图1 MRSA-RAPD基因分型图谱Figur e 1 Fingerprint of RAPDanalyses of MRSA

3 讨论

SA能产生多种毒素及酶,是引起临床感染的重要病原菌。常见的感染有外科切口等局部化脓性感染和肺炎、心内膜炎、败血症、脓毒症等全身感染。本研究结果显示,SA主要分离自呼吸道标本痰液和咽拭子,其次为伤口分泌物,血液也有较高的检出率 (13.79%),表明呼吸道仍是本院儿科 SA感染的首发部位。从分布来看,主要来自新生儿科、儿科 PICU和呼吸科,表明这些科室易发生 SA感染[4]。其中新生儿科所占比例最高,这与新生儿免疫系统尚未成熟、对环境中的 SA高度易感有关。

耐药监测显示,348株 SA未发现对糖肽类、噁唑烷酮类代表药物利奈唑胺耐药株,表明这些药物仍是 SA感染重症患儿治疗首选和最有效的药物。其中利奈唑胺作为一种新药,临床在使用时应做好耐药性监测,避免滥用[5]。喹诺酮类、头孢类、利福平、呋喃妥因的耐药率也较低,表明这些药物对SA有较好的抗菌活性。但喹诺酮类药物可在 3～4 d内产生耐药,应注意耐药性监测。348株 SA中334株 SA产 β-内酰胺酶,对青霉素的耐药率为100.00%,对其余 β-内酰胺类药物耐药率为 6.03%～49.14%。值得注意的是,苯唑西林耐药率为 9.77%,与头孢菌素类耐药率 8.62%～12.93%无差异;表明治疗 SA感染头孢菌素类并不比苯唑西林优越,苯唑西林仍是治疗儿童 SA感染的敏感药物。四环素、大环内酯类、阿莫西林/棒酸、复方新诺明和克林霉素耐药率较高,均大于40%,表明这些药物不宜用于 SA感染的治疗。阿莫西林/棒酸作为 β-内酰胺酶抑制剂,其耐药率却远高于除青霉素外的β-内酰胺类药物及哌拉西林/他唑巴坦,导致这种差异可能与用药习惯相关,是否与耐酶抑制剂广谱酶 (IRBL)产生有关,还需进一步研究。

348株 SA中 MRSA检出率为 9.77%,与本地区8.30%[6]、上海 9.7%[7]相近,低于 Mahnarin 2008年度报告 0～14岁儿童的 32.7%[8],远低于 Mohnarin 2008年度报告的52.3～76.9%[9],表明 MRSA检出率在不同地区和人群中差异较大。这可能与不同地区用药习惯不同,病例年龄构成、标本来源等有关。本组 348例标本均来自住院患儿,新生儿及婴幼儿所占比例较大,MRSA检出较低可能与临床用药比较谨慎有关。MRSA对所有 β-内酰胺类药物均有不同程度耐药,耐药率 23.53%～100.00%,这与 MRSA染色体携带的 mecA基因编码与 β-内酰胺类抗菌药物亲和力极低的替代性青霉素结合蛋白有关。同时 mec基因可整合红霉素、四环素等多种耐药基因,导致其对红霉素和四环素呈高度耐药性[10]。本研究中MRSA对四环素和红霉素耐药率均高达 82.35%,其中对大环内酯类 3种抗菌药物同时耐药。对万古霉素、替考拉林、利奈唑胺、呋喃妥因和利福平耐药率与 MSSA无差异,对其余抗菌药物耐药率均高于 MSSA。

近年来,MRSA引起的严重感染在全球范围内迅速增加,常有暴发流行的报道。因此,如何有效预防和控制 MRSA感染已迫在眉睫。目前主要应用 RAPD和脉冲场电泳对细菌进行基因分型,以了解其流行情况。RAPD是通过 PCR介导使所有与随机引物互补的模板基因组 DNA得到扩增,产生一系列大小不同的 DNA片段,经电泳呈现出不同的 DNA指纹图进行分型。脉冲场电泳被视为细菌基因分型的金标准,分辨力高,且易标准化;但样本制备繁琐,且需要特殊的电泳仪器,电泳耗时长。而 RAPD方法经济、简便、快速、灵敏,最大特点在于靶基因序列未知情况下设计任意 10个碱基单链寡聚核苷酸片段引物,其分型结果与脉冲场电泳基本一致,可作为细菌分子生物学流行病学研究的可靠方法。

本研究应用 RAPD方法对分离的 34株 MRSA进行基因分型,共分为 6个基因型,其中以Ⅰ型感染为主 (64.71%)。儿科 PICU分离的 MRSA菌株最多,以Ⅰ型感染为主。研究发现该病区存在 MRSA暴发[11],暴发病例为 6例,且存在 2个基因型的 MRSA流行;聚集性病例为3例,其余均为散发性病例,这主要与 ICU患儿住院时间较长、侵袭性操作、使用抗菌药物、合并感染和其他神经症状等均大大增加了感染 MRSA的几率[12]。新生儿科、呼吸科、儿外科和儿内科分离得 MRSA菌株较少,且分布也较分散;但除有各自不同的基因型外,还存在与儿科 PICU相同的基因型,可能上述科室与儿科 PICU间时有患儿转入或转出有关。

总之,在对感染 SA患儿抗感染治疗的同时,应加强细菌耐药性监测,及时掌握耐药性变迁,正确、合理地使用抗菌药物,是预防耐药性进一步蔓延的有效措施。同时,采用 RAPD方法对 MRSA进行同源性分析,对有效控制医院感染、确定MRSA引起的感染暴发及其传播途径有重要意义。

1 Weigel LM,Clewell DB,Gill SR,et al.Genetic analysis of a highlevel vancomycin-resistant isolate of staphylococcus aureus[J].Science,2003,302(5650):1569-1571.

2 马晓红,徐文建,王会萍,等 .儿科金黄色葡萄球菌感染现况及耐药谱分析 [J].中国实用儿科杂志,2010,25(5):391-393.

3 Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Performance standards antimicrobial susceptibility testing sixteenth informational supplement CLSI,M100-S16[S].Pennsylvania CLSI,2006,26(23):38-43.

4 Khan A,Lampitoc M,Salaripour M,et al.Rapid control of amethicillin resistant Staphylococcus aureus(MRSA)outbreak in a medical surgical intensive care unit(ICU)[J].Can J Infect Control,2009,24(1):12-16.

5 郭利涛,刘昱,王雪,等.利奈唑胺成功治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌致颅内感染一例 [J].中国全科医学,2010,13(11):42-43.

6 甄宏,谢庆玲,农生州,等 .儿童下呼吸道感染的病原菌及耐药情况分析 [J].广西医学,2009,31(2):260-262.

7 付盼,何磊燕,王爱敏,等.2006至 2009年复旦大学附属儿科医院呼吸道感染患儿5种常见细菌构成比和耐药性分析 [J].中国循证儿科杂志,2010,5(5):371-376.

8 杨亚静,夏万敏,樊映红,等.Mohnarin 2008年度报告:0～14岁儿童细菌耐药监测 [J].中国抗生素杂志,2010,35(7):529-535.

9 徐修礼,张鹏亮,樊新,等.Mohnarin 2008年度报告:葡萄球菌和肠球菌耐药监测 [J].中国抗生素杂志,2010,35(7):536-542.

10 Srenhen M,Ortqvist A,Ringtberg H,et al.Validity of routine surveillance data:a casestudy on Swedish notificationsof Methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Euro Surveill,2009,14(30):219-281.

11 Goto H,Takeda H,Kawai S,et al.Susceptibilities of bacteria isolated from patients with lower respiratory infectious diseases to antibiotics(2005)[J].Jpn J Antibiot,2008,61(4):209-240.

12 张连芝,王欣,周密,等.医院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染现状的分析 [J].中国实验诊断学,2010,14(6):892-894.