色象中药对人 A375黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响*

洪逊强 杨 柳 刘利利 潘恩山 南方医科大学中西结合医院皮肤科(广州 510315)

色素障碍性皮肤病易诊难治,目前临床上尚缺乏较有效的治疗方案,对其机理仍不十分清楚。中医在长期医疗实践中积累了“以白治黑,以黑治白”的临床经验。2007年以来,我们对中药色象理论形成的背景及研究意义多次在全国中西医结合、中医及中西医结合皮肤病专业学术会议进行交流[1～3],首次将这种表明药材颜色与疗效相关的现象,称之为“中药色象”。将这种治疗色素病色效相关的中药,称之为“色象中药”。本研究通过查阅大量的文献资料及临床资料,筛选出中医传统治验及现代研究表明治疗色素病有效的黑白两类中药各 10种,研究色象中药对黑素细胞增殖及黑素合成的影响,探讨色象中药与色素代谢的相关性,为色象理论及临床辨证用药提供科学依据。

1 实验材料

1.1 黑素瘤细胞株来源 人 A375黑素瘤细胞株由中国科学院上海细胞研究所提供。

1.2 实验中药 包括制首乌、熟地、女贞子、菟丝子、补骨脂、红花、丹参、鸡血藤、墨旱莲、益母草、白茯苓、白术、白蒺藜、白及、白芷、桃仁、当归、山药、白芍、薏苡仁,购自南方医科大学南方医院中药房,经南方医科大学中医系中药炮制教研室鉴定。

1.3 试剂 M T T(四甲基偶氮唑蓝)、二甲基亚砜(DMSO)、0.25%胰蛋白酶-EDT A(美国 Sigma公司),DMEM培养液(高糖)、10%胎牛血清(美国 Gibco公司),其它试剂均为国产分析纯。

1.4 主要仪器 倒置显微镜(Nikon公司),自动酶标仪(芬兰 Thermo公司 )等。

2 方 法

2.1 实验药物分组 依据饮片的外在颜色分为黑白两组,每组各选 10味药作为代表药 ,①黑 (深 )色组 (制首乌、熟地、女贞子、菟丝子、补骨脂、红花、丹参、鸡血藤、墨旱莲、益母草 );②白(浅)色组(白茯苓、白术、白蒺藜、白及、白芷、桃仁、当归、山药、白芍、薏苡仁)。

2.2 中药药液的制备 分别称取上述 20味中药,单味药物饮片经鉴定后置砂锅中,加相当于药材量的 8倍的蒸馏水浸泡 2h,煮沸 30min过滤。药渣加 5倍水继续煎煮,煮沸 30min过滤。合并两次滤液,于水浴上分别进行浓缩 ,用不含胎牛血清培养基进行稀释,使药物终质量浓度为 20μg/mL、10μg/mL、5μ g/mL,储存备用。

2.3 黑素瘤细胞增殖的测定[4]采用四甲基偶氮唑蓝比色法(M TT法),细胞常规培养后,取对数生长期细胞常规消化 ,调整细胞为 5× 104个 /mL,取 100 μl接种于 96孔板,37℃及 5% CO2下孵育 24h后,每孔加入 100μl不含胎牛血清培养基稀释好的中药,使药物终质量浓度为 20 μg/mL、10 μg/mL、5μ g/mL,每个浓度设 3个复孔,并设对照组:单纯培养基组、中药对照组(培养基+中药 )和空白对照组(培养基+细胞),置于孵箱中作用 48h后,弃上清液,用不含 Ca2+和 Mg2+的 PBS液洗 2遍,每孔加入 5g/L的 M T T溶液 20μl,于 37℃及 5%CO2下孵育下 4h,弃上清液,每孔加 150μl DM SO,振荡 10min,在酶标仪 490nm波长下测量各孔吸光度值(OD值),每组重复 3次,取平均值。用吸光度值表示细胞增殖。细胞增殖=实验组的吸光度值 中药对照组的吸光度值;空白对照组细胞增殖=空白对照组的吸光度值 单纯培养基对照组的吸光度值。

2.4 黑素合成含量测定[5,6]NaOH裂解法,黑素细胞接种方法同上,设立对照组同前。药物作用 48h后,弃上清液,用不含 Ca2+和 Mg2+的 PBS液洗 2遍,然后加入 100μL1N NaOH(含 10%DM SO)在 37℃水浴保温 2h,用酶标仪测定490nm波长的吸光度值,每组重复 3次,取平均值。用吸光度值表示黑素含量,黑素含量=实验组的吸光度值 中药对照组的吸光度值;空白对照组黑素含量=空白对照组的吸光度值 单纯培养基对照组的吸光度值。

2.5 统计学方法 利用 SPSS13.0统计软件,采用单因素方差分析进行统计处理。

3 结 果

3.1 实验中药对黑素瘤细胞增殖的影响 如表 1、表 2。结果表明:黑色组药物中除益母草外,其余 9种对黑素细胞增殖均有促进作用,与空白对照组相比,差异均有显著性(P＜0.05或 P＜0.01);白色组药物中除桃仁、薏苡仁、山药外,其余 7种对黑素细胞增殖均有明显抑制作用,差异均有显著性(P＜0.05或 P＜0.01)。另外 ,研究发现白蒺藜、白芷、白茯苓、白芍、熟地这五味药物具有双向调节作用,而桃仁虽为白色,但却起着促进作用。益母草、薏苡仁、山药与空白对照组相比,差异均无显著性(P＞ 0.05)。

表1 黑色组中药对细胞增殖的影响(±s)

表1 黑色组中药对细胞增殖的影响(±s)

与空白对照组比较:△P＜0.05,▲P ＜0.01

不同浓度药物作用48h后OD值中 药5 μg/mL 10μ g/mL 20 μg/mL空白对照组OD值制首乌 0.5327±0.0448 0.5826±0.0189▲ 0.6366± 0.0146▲ 0.4961±0.0174熟 地 0.4432±0.02581△ 0.5476±0.0283 0.5754± 0.0368△ 0.4961±0.0174女贞子 0.5004± 0.0192 0.5273± 0.0150 0.5337± 0.0246△ 0.4961± 0.0174补骨脂 0.5696±0.0318△ 0.5881±0.0577△ 0.6112± 0.0175▲ 0.4961±0.0174红 花 0.5153±0.0274 0.5481±0.0263△ 0.5748± 0.0251▲ 0.4961±0.0174菟丝子 0.5733±0.0302△ 0.5772±0.0335△ 0.6071± 0.0229▲ 0.4961±0.0174丹 参 0.5703±0.0385△ 0.5989±0.0315▲ 0.6354±0.0185▲ 0.4961±0.0174鸡血藤 0.5726±0.0269▲ 0.5856±0.0260▲ 0.6336± 0.0303▲ 0.4961±0.0174墨旱莲 0.5582± 0.0322△ 0.5271± 0.0265 0.5085± 0.0282 0.4961± 0.0174益母草 0.5080± 0.0237 0.5192± 0.0383 0.5257± 0.0263 0.4961± 0.0174

表2 白色组中药对细胞增殖的影响(±s)

表2 白色组中药对细胞增殖的影响(±s)

与空白对照组比较:△P＜0.05,▲P ＜0.01

不同浓度药物作用48h后OD值中 药5 μg/mL 10μ g/mL 20 μg/mL空白对照组OD值山 药 0.4902± 0.0174 0.4810± 0.0253 0.4663± 0.0235 0.4961± 0.0174白 术 0.4727±0.0295 0.4525±0.0178△ 0.4482± 0.0169△ 0.4961±0.0174白蒺藜 0.4277±0.0203▲ 0.4516±0.0086△ 0.5404± 0.0375△ 0.4961±0.0174白 及 0.4633±0.0233 0.4503±0.0193△ 0.4433± 0.0178△ 0.4961±0.0174桃 仁 0.4972± 0.0215 0.5235±0.0234 0.5425± 0.0175△ 0.4961± 0.0174白 芷 0.4272±0.0191▲ 0.4487±0.0152△ 0.5348±0.0238△ 0.4961±0.0174当 归 0.4734±0.0094 0.4606±0.0135△ 0.4529± 0.0200▲ 0.4961±0.0174白茯苓 0.5448±0.0223△ 0.4912±0.0152 0.4156± 0.0248▲ 0.4961±0.0174白 芍 0.5335±0.0177△ 0.4950±0.0134 0.4616± 0.0140△ 0.4961±0.0174薏苡仁 0.4968± 0.0306 0.4717± 0.0174 0.4848± 0.0254 0.4961± 0.0174

3.2 实验中药对黑素含量的影响 如表 3、表 4。结果表明:黑色组药物中除益母草外,其余 9种对黑素细胞合成均有促进作用,与空白对照组相比较,差异均有显著性(P＜0.05或P＜0.01);白色组药物中除桃仁、薏苡仁外,其余 8种对黑素细胞增殖均有明显抑制作用,与空白对照组比较,差异均有显著性(P＜0.05或 P＜0.01)。另外,白蒺藜、白芷、白茯苓、白芍、熟地这五味药物具有双向调节作用,而桃仁虽为白色,但却起着促进作用。益母草、薏苡仁与空白对照组相比,差异均无显著性(P＞ 0.05)。

表3 黑色组中药对黑素含量的影响(±s)

表3 黑色组中药对黑素含量的影响(±s)

与空白对照组比较:△P＜0.05,▲P ＜0.01

不同浓度药物作用48h后OD值中 药5 μg/mL 10μ g/mL 20 μg/mL空白对照组OD值制首乌 0.4500± 0.0279 0.4644± 0.0267 0.4897± 0.0108△ 0.4265± 0.0359熟 地 0.3721±0.0265△ 0.4528±0.0234 0.4982± 0.0254△ 0.4265±0.0359女贞子 0.4349± 0.0276 0.4614± 0.0363 0.4908± 0.0183△ 0.4265± 0.0359补骨脂 0.4462±0.0216 0.4746±0.0242△ 0.5048± 0.0152▲ 0.4265±0.0359红 花 0.4374±0.0291 0.4828±0.0297△ 0.5014± 0.0182△ 0.4265±0.0359菟丝子 0.4842±0.0163△ 0.5016±0.0288▲ 0.5252± 0.0245▲ 0.4265±0.0359丹 参 0.5132±0.0208▲ 0.5339±0.0242▲ 0.5688±0.0303▲ 0.4265±0.0359鸡血藤 0.5216±0.0289▲ 0.5688±0.0369▲ 0.6271± 0.0360▲ 0.4265±0.0359墨旱莲 0.5022± 0.0337△ 0.4406± 0.0342 0.4515± 0.0399 0.4265± 0.0359益母草 0.4415± 0.0387 0.4475± 0.0226 0.4682± 0.0162 0.4265± 0.0359

表4 白色组中药对黑素含量的影响(±s)

表4 白色组中药对黑素含量的影响(±s)

与空白对照组比较:△P＜0.05,▲P ＜0.01

中 药不同浓度药物作用48h后OD值5 μg/mL 10μ g/mL 20 μg/mL空白对照组OD值山 药 0.4156± 0.0152 0.3921±0.0084 0.3736± 0.0254△ 0.4265± 0.0359白 术 0.4189±0.0119 0.3728±0.0268△ 0.3580± 0.0259△ 0.4265±0.0359白蒺藜 0.3178±0.0183▲ 0.3662±0.0183△ 0.4854± 0.0366△ 0.4265±0.0359白 及 0.4034±0.0108 0.3653±0.0273△ 0.3378± 0.0180▲ 0.4265±0.0359桃 仁 0.4409±0.0210 0.4840±0.0220△ 0.5000± 0.0338△ 0.4265±0.0359白 芷 0.3063±0.0165▲ 0.3824±0.0120 0.4845± 0.0342△ 0.4265±0.0359当 归 0.4059± 0.0200 0.3877±0.0207 0.3510± 0.0267△ 0.4265± 0.0359白茯苓 0.4891±0.0348△ 0.3789±0.0242 0.2972± 0.0179▲ 0.4265±0.0359白 芍 0.4890±0.0390△ 0.3674±0.0223△ 0.3525±0.0189△ 0.4265±0.0359薏苡仁 0.4186± 0.0139 0.4145± 0.0160 0.4150± 0.0221 0.4265± 0.0359

4 讨 论 中医在长期的临床实践中积累了应用白色药物 (如白芷、白附子、白茯苓等)治疗色素沉着类皮肤病 ,应用黑色药物 (如首乌、熟地、黑芝麻等)治疗色素减退类皮肤病的治疗经验。近年来,国内已经有更多的同行注意到了药材本身颜色与药效的关系,如湖南中医药大学欧阳恒教授[7]总结此类以白治黑,以黑治白之法为“以色治色法”,研创紫铜消白方(主要由紫铜、丹参、紫草、红花等多味紫红色药材组成)治疗白癜风取得较好临床疗效而获 1994年度国家中医药管理局科技进步奖。杨志波[8]对“以色治色法”治疗色素障碍性皮肤病进行初步研究,认为颜色深的药物可能含有较多的增色物质,这些物质能促进黑素细胞的增殖以及酪氨酸酶的活性,从而促进黑色素的合成;颜色淡的药物中可能含有较多的褪色物质,这些物质能抑制黑素胞的增殖以及酪氨酸酶的活性。另外,许爱娥[9]等将对酪氨酸酶激活率较高的墨旱莲、无花果、沙苑子 3种中药加入活性碳脱色处理后,发现 3种中药均不能再激活酪氨酸酶,提示中药的色素与酪氨酸酶的活性具有一定的相关性。

本研究从新的角度出发,运用新的理论假说,探讨中药对细胞增殖及黑素合成的影响,结果发现黑色或深色类药物促进细胞增殖及黑素合成的作用更明显,而白色或浅色类药物的抑制作用更明显。说明药材颜色与色素代谢调节存在一定的相关性,为临床应用中药治疗色素代谢障碍性疾病用药提供了较科学的实验依据。同时,研究还发现并非所有药物都具有这一特性,部分药物具有双向调节作用,少数药物具有相反调节作用或者无调节作用,而白蒺藜的双向调节作用与我们以往的研究结果[10-11]一致。另外,有些药物的作用与以往报道略有不同或相反,这可能与药物产地、炮制加工方法、药物浓度以及实验条件不同等诸多因素有关。综合我们的实验结果,提示临床上应用色象理论指导治疗色素沉着性皮肤病(黄褐斑)或色素脱失性皮肤病(白癜风)是可行的,针对不同的疾病其用药应有所不同,前者宜多用浅色类药物治疗,后者宜多用深色类药物治疗。当然,把药物进行脱色处理后对细胞增殖及黑素合成有无调节作用?中药的颜色种类繁多,如何进行合理归类?不同颜色配伍对实验结果的影响如何?实验结果与临床疗效的关系等问题都有待更深入的研究。

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