短期应用利尿剂对正常大鼠尿液水通道蛋白 2排泄浓度的影响研究

林 晟,许顶立,赖文岩

水通道蛋白 2(aquaporin-2)是迄今为止发现的最具病理生理意义的水通道蛋白之一,对维持机体水平衡和调节体液容量至为重要,主要分布在肾脏集合管主细胞胞浆内和小管侧细胞膜上,在体内主要受血管加压素 (AVP)调节[1-2];其中部分肾脏 AQP2蛋白可脱落于小管腔经尿液排出[3]。尿液AQP2浓度的检测可能是一些临床重要疾病,如心力衰竭水潴留等的重要检测指标[4]。利尿剂是临床常用药物,主要用于调节机体水钠代谢,利尿剂和 AQP2两者之间的相互联系一直是临床较为关注的问题。本实验就生理状况下,短期运用呋塞米、双氢克尿噻和安体舒通对大鼠尿液中 AQP2的改变进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性 SD(Sprague dawley)大鼠 30只,体质量 180～250g(购自南方医科大学南方医院实验动物中心)。

1.1.2 试剂 呋塞米片,双氢克尿噻片,安体舒通片。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 将 18只 SD大鼠随机分为呋塞米组、安体舒通组、双氢克尿噻组,每组 6只。放置代谢笼中,自由进食水 (饲料由南方医院动物所提供)。环境温度控制在 25～28℃左右。动物适应 3d后开始灌药,灌药 1次/d。将药物溶于2ml去离子水中,注入胃内。呋塞米组:20mg/kg,双氢克尿噻组:25mg/kg,安体舒通组:20mg/kg。

1.2.2 尿液的收集 每天收集大鼠尿液记尿量,在 4℃以3000r/min离心 10min,去除细胞残骸和食物残渣,加入蛋白酶抑制剂 PMSF,放入-70℃低温冰箱,尿渗量由南方医院肾内科实验室采用冰点抑制法检测。

1.2.3 ELISA 测定尿液 AQP2浓度[5]尿液用 0.05%SDSPBS等倍稀释后,取 50m l加入 96孔酶标板,37℃预包被30min,然后 4℃过夜。每 1个孔用洗涤缓冲液 (PBS含0.05%Tween)清洗 1次,然后加入封闭液 (PBS含 3%牛血清白蛋白)100μl 37℃,45min。去除封闭液,加入一抗 (兔抗鼠 1∶1000,用 3%BSA-PBS稀释)37℃,温育 2h。然后用洗涤缓冲液清洗 4次,1min/次。稍晾干后加入二抗 (1∶2000),37℃,温育 90min,用洗涤缓冲液冲洗 4次,每次1min。晾干后加入底物 0.1%ATM显色 10min,用 2mol/L H2SO4终止反应。应用酶标仪在 450rm处测定吸光度 (od值)。

1.3 统计学方法 应用 SPSS12.0软件行 One-Way ANOVA统计分析,计量资料以 (±s)表示,各组间比较采用 SNK法,以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尿量的变化 各实验组用药 7d后与用药前相比尿量均显著增多 (P＜0.05),但 3者增加的趋势不同。应用呋塞米后尿量显著增加至用药后第 4天达峰值,其后尿量有所减少。双氢克尿噻组和安体舒通组用药后呈显著增加趋势 (见表1～3)。

2.2 尿渗量的变化 呋塞米组用药后尿渗量呈显著减少趋势(P＜0.05),至用药后第 4天左右,改变渐趋平稳;而双氢克尿噻组用药后第 1天尿渗量减少 10%左右,其后呈逐渐增加趋势,至用药后第 6天,有显著增加意义;安体舒通组的尿渗量变化则未见有明显变化趋势 (见表1～3)。

2.3 尿肌酐的变化 呋塞米组用药后尿肌酐呈显著降低趋势(P＜0.01);双氢克尿噻组用药后第 1天尿肌酐减少 30%左右,此后呈明显降低趋势;安体舒通组用药后第 1天尿肌酐减少 40%左右,其后改变有轻微波动,但总体呈降低趋势 (见表1～3)。

2.4 尿液 AQP2的浓度 呋塞米组尿液 AQP2浓度用药后第 1天增加约 15%左右,至第 3天左右逐渐增加至峰值;双氢克尿噻组用药后第 1天增加约 13%左右,其后呈逐渐增加趋势,至第 7d达峰值;安体舒通组在用药前 3d其值增加明显,其后虽有增加,但改变不明显 (见表1～3)。

2.5 尿液 AQP2的排泄量 (经尿肌酐校正) 3组药物其排泄率均呈显著增加趋势 (P＜0.05),其中呋塞米组增加最为明显,双氢克尿噻组次之,安体舒通组最弱 (见表1～3)。

表1 呋塞米组用药 7d尿量、尿渗量、尿肌酐及 AQP2排泄 (±s)Tab le 1 The clinical effect in Furosemide group

表1 呋塞米组用药 7d尿量、尿渗量、尿肌酐及 AQP2排泄 (±s)Tab le 1 The clinical effect in Furosemide group

用药前 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d尿量(m l) 4.5±1.0 10.7±1.5 16.4±1.4 19.9±1.4 23.3±3.4 22.7±2.7 22.3±2.5 21.4±2.8尿渗量(mosm/kgH2 O) 2058±291 1625±272 1362±194 1244±252 1124±198 1073±215 1154±221 1018±187尿AQP2浓度(ng/m l) 8.1±1.4 10.7±1.5 11.6±1.7 12.7±2.0 11.4±1.3 11.9±1.3 12.7±1.7 13.2±2.0尿肌酐(mmol/ml) 3060±221 1814±281 1069±430 690±214 490±225 327±121 192±56 182±64尿 AQP2/Cr(pg/μmol) 2.8±1.2 7.6±4.83 13.4±7.7 20.3±9.4 31.3±10.2 42.4±17.2 67.4±22.4 78.6±30.4

表2 双氢克尿噻组用药 7d尿量、尿渗量、尿肌酐及 AQP2排泄 (±s)Table2 The clinical effect in Dihydrocholorothiazide group

表2 双氢克尿噻组用药 7d尿量、尿渗量、尿肌酐及 AQP2排泄 (±s)Table2 The clinical effect in Dihydrocholorothiazide group

用药前 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d尿量(m l) 4.4±1.6 7.4±2.4 12.4±2.1 13.2±1.8 16.9±3.4 18.3±1.9 19.4±1.5 20.3±3.8尿渗量(mosm/kgH2 O) 2122±186 1812±234 2034±194 2334±338 2366±439 2553±288 2654±358 2776±330尿AQP2浓度(ng/m l) 6.6±1.4 8.3±1.8 9.2±1.4 11.1±0.9 11.4±1.2 11.2±1.3 12.7±1.1 13.2±1.4尿肌酐(mmol/ml) 3164±741 2265±524 1913±524 986±231 701±312 503±219 460±170 328±142尿 AQP2/Cr(pg/μmol) 2.4±1.2 4.0±1.1 5.7±2.5 13.6±3.6 24.4±12.6 28.2±15.1 28.6±14.4 47.1±26.8

表3 安体舒通组用药 7d尿量、尿渗量、尿肌酐及 AQP2排泄 (±s)Table3 The c linical effect in Antisterone group

表3 安体舒通组用药 7d尿量、尿渗量、尿肌酐及 AQP2排泄 (±s)Table3 The c linical effect in Antisterone group

用药前 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d尿量(m l) 4.7±1.0 7.4±1.5 10.3±1.6 12.0±2.4 13.2±2.6 14.4±2.4 16.3±2.8 17.1±2.6尿渗量(mosm/kgH2 O) 2260±382 2145±3377 2020±207 1850±234 1973±314 1975±346 1978±194 2192±350尿AQP2浓度(ng/m l) 7.8±2.1 8.6±1.4 10.2±1.2 11.4±1.0 12.0±1.8 10.2±1.0 11.1±1.1 11.4±2.2尿肌酐(mmol/ml) 3416±887 2850±614 1593±430 1093±654 932±339 771±417 470±246 449±312尿 AQP2/Cr(pg/μmol) 2.4±1.2 4.3±2.5 6.8±2.3 15.4±1.8 15.7±8.4 18.8±11.0 31.5±18.4 36.3±18.1

3 讨论

AQP2是 1988年克隆发现的水通道家族中的一员,主要分布在肾脏集合管主细胞的胞浆内和管腔侧细胞膜上,在机体内主要受 AVP调节以出胞的方式和管腔膜融合,从而水通道开放,水重吸收增加。在尿液的冲刷作用下部分 AQP2可脱落排出,正常的水供应条件下每天大约有 3%～4%的肾内总 AQP2经尿液排出,尿液中检测到的 AQP2含量与主细胞管腔膜上AQP2呈正相关,同时也与血液中 AVP的作用和肾脏 AQP2水平相关。我们发现在心力衰竭的大鼠和患者都存在有尿液中AQP2的排泄增加,尿液中的 AQP2可作为临床监测心力衰竭时水钠潴留的重要指标[6-7]。

利尿剂是目前临床运用较多的调节机体水电解质平衡的重要药物,尤其在充血性心力衰竭的治疗中有着较为广泛的运用。各种利尿剂的作用机制各不相同,对 AQP2的影响也不一致,我们通过 ELISA方法检测尿液中的 AQP2排泄来初步评价各种利尿剂对其影响,从而更好地指导临床上对于心力衰竭病人治疗过程中的 AQP2的监测。但由于尿液 AQP2浓度受到尿量的影响,故将每份尿液 AQP2浓度与尿肌酐相比,用尿液AQP2/肌酐来评价尿液 AQP2的排泄率。Uenishi F等[8]提出,尿液 AQP2/肌酐与尿渗量呈正相关。

在我们的实验中发现,3种利尿药物作用均可引起尿量和尿液 AQP2排出的明显增加,这与一些相关报道结果一致[9],但增加的趋势各不相同,且尿渗量的改变也不相同。呋塞米在药物干预第 1天即引起尿量的显著增加,至干预后第 4天达到尿量峰值,其后尿量增加减少,但仍维持在一个较高水平,其尿渗量的改变亦表现为干预前 4天显著下降而其后渐趋平稳。其尿液 AQP2的排泄率在早期随着尿液增加排出增加,即使尿量有所减少,其排泄率仍呈增加趋势;而双氢克尿噻和安体舒通虽然引起尿量增加没有呋塞米明显,但总体呈增加趋势,且伴随着尿量的增加,AQP2的排泄率也显著增加。这与双氢克尿噻引起尿渗量增加相一致,而安体舒通组尿渗量改变不明显,可能与其利尿作用较弱且具有保钾功能有关。

呋塞米组 AQP2排泄率随着尿量增加而增加的同时,在尿量开始有所减少的药物干预后第 4天仍有所增加,所以我们认为在呋塞米引起的 AQP2排出增加的原因中,除了尿量增加这一影响因素外,管腔膜上的 AQP2的增加更是其尿量减少后排出率继续增加的主要原因,这可能正是临床上使用呋塞米后期出现利尿效果减弱的机制之一。

1 Nislesen S,Agre P.The aquaporin family of water channels in kidney[J].Kidney Int,1995,48(40):1057-1068.

2 许顶立,任昊,Martin PY,等.充血性心力衰竭大鼠肾脏Aquaporin-2水通道蛋白基因的表达 [J].中华医学杂志,1998,78(2):118-120.

3 Umenishi F,Summer SN,Cadnapaphornchai M,et al.Comparison of three methods to quantify urinary aquaporin-2 protein[J].Kidney Int,2002,62(6):2288-2293.

4 许顶立,任昊.慢性心力衰竭水潴留机制的研究进展 [J].第一军医大学学报,2001,21(1):65-67.

5 江荣炎,许顶立,赖文岩,等.间接酶联免疫吸附法定量检测大鼠尿液水通道蛋白-2浓度 [J].中华老年心血管病杂志,2005,4:261-263.

6 许顶立,任昊,邓英姿,等.肾脏 Aquaporin 2水通道蛋白的检测及其在充血性心力衰竭的应用 [J].肾脏病与透析肾移植杂志,1998,7:196-198.

7 Xu DL,Martin PY,Ohara M,et al.Upregulation of aquaporin-2 water channel expression in chronic heart failure rat[J].JClin Invest,1997,99(7):1500-1505.

8 Starklint J,Bech JN,Nvvad O,etal.Increased urinary aquaporin-2 excretion in response to furosem ide in patients with chronic heart failure[J].Scand JClin Lab Invest,2006,66(1):55-66.

9 Starklint J,Bech JN,Nvvad O,et al.Urinary excretion of aquaporin-2 after furosemide and felodipine in healthy humans[J].Scand J Clin Lab Invest,2005,65(3):249-261.