麝香酮干预血瘀证乳腺癌组织血管生成相关因子表达研究*

西安交通大学医学院第一附属医院

郭少贤 刘永惠 常 靖△ 夏欣欣 王 瑞 华 莎 （西安 710061）

肿瘤的增殖、转移,与肿瘤微环境有十分重要的关系,对肿瘤微环境的研究已成为目前研究的热点之一,而肿瘤细胞持续缺氧可以诱导新生血管生成,可能为肿瘤增殖、转移提供一定的环境与条件。现代中医研究认为,肿瘤及其转移存在血瘀证,与肿瘤增殖、转移存在正相关关系。为深入研究血瘀证与肿瘤微环境及肿瘤的增殖、转移的关系,本实验应用麝香酮干预血瘀证裸鼠乳腺癌组织血管生成相关因子 VEGF、bFGF的表达,探讨麝香酮对肿瘤微环境的影响,进一步阐述其抗肿瘤增殖、转移的作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞系 雌性裸鼠40只,体重 （20±2）g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证号码SCXK（沪）2007-0005,饲养于动物实验室 SPF环境中。乳腺癌MDA231细胞株购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 药物 麝香酮购自德国Dr（批号 90527CY）,肾上腺素购自上海禾丰制药有限公司 （批号 H 31021062）。

1.3 仪器与试剂 SCW-BCM生物超净工作台系苏州市长春电子仪器厂生产;台式多功能离心机系长沙市鑫奥仪器仪表有限公司生产;普通光学显微镜购自日本 Olympus公司;电热恒温水浴箱 DR-HW-2购自北京西城区医疗器械厂;CO2细胞培养箱购自上海控菱科技有限公司;VEGF一抗及bFGF一抗购自北京康为世纪生物科技有限公司;VEGF二抗及bFGF二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4方法

1.4.1 细胞培养:乳腺癌 MDA 231细胞株用含 10%胎牛血清的 RMPI1640培养液培养,细胞长满单层后用 0.25%胰酶消化,培养液吹打离心,收集细胞用 PBS稀释,浓度调至 5×106。

1.4.2血瘀模型:将 40只裸鼠分成两组,空白组 10只,皮下注射生理盐水 0.2 mL/只,连续 7日;血瘀组 30只,皮下注射 0.01%肾上腺素 0.2mL/只,连续 7日。[1]

1.4.3 测定指标与方法:随机选取血瘀组中 10只裸鼠和空白组 10只裸鼠,眼球取血脱臼处死。由于 1只裸鼠的血量不足 1个检测样本,故将同组的 2只裸鼠的血样合并成 1个样本,每组各为 5个样本,由本院的检验科测定。全血黏度测定:取血 3mL,用适量肝素粉抗凝,在血液流变仪上,测定在切变率为 1S-1、5S-1、30S-1、200S-1的全血黏度。

1.4.4 接种与给药:将其余 20只裸鼠,每只裸鼠于右后背部皮下接种细胞液 0.2mL。接种 10天肿瘤长至 1mm3时,随机分为两组,血瘀加瘤组 10只;麝香酮组 10只。给药剂量均采用人与动物计量换算法确定。①血瘀加瘤组:每天灌胃生理盐水 0.2 mL,连续 14天。②麝香酮组:麝香酮给予 2mg∕kg灌胃,连续 14天。

1.4.5 免疫组化:脱臼处死余下 20只裸鼠,取出瘤体,放入 4%多聚甲醛固定液中,经组织脱水、透明、渗蜡、石蜡包埋,以 5μm厚度连续切片,免疫组化采用 SP法,按照试剂盒说明书检测VEGF及 bFGF的表达。用PBS作为一抗做阴性对照。

1.4.6 结果判定:VEGF免疫组化染色以胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒者为阳性,结果评分,阳性细胞范围分为 0～3级:无阳性细胞为 0,1%～10%为 1,11%～50%为2,51%以上为 3;染色强度分为 0～3级,阴性为 0,弱阳性为 1,中度阳性为 2,强阳性为 3,[2]两者之和即为该片的 VEGF免疫组化评分,bFGF的表达也采用该评分标准。

2 结果

2.1 血液流变学 空白组与血瘀组血液流变学结果经t检验后,两组在 1S-1、5S-1、 30S-1、 200S-14个指标间差异均有显著性 （P＜0.05）,可以认为两组的全血黏度有差异,详见表 1。

2.2 VEGF和bFGF在血瘀加瘤组、麝香酮中的表达情况 经 t检验后,麝香酮组与血瘀加瘤组比较差异均有显著性 （P＜0.05）,详见表 2。

表1 血液流变学结果 （±s）

表1 血液流变学结果 （±s）

指标 空白组 血瘀组1S-1 29.47±7.28 46.02±10.94 5S-1 9.66±2.71 14.54±3.08 30S-1 4.21±1.50 6.11±3.46 200S-1 2.09±1.34 3.97±1.67

表2 VEGF和 bFGF结果 （±s）

表2 VEGF和 bFGF结果 （±s）

指标 血瘀加瘤组 麝香酮组VEGF 5.34±0.23 2.90±0.25 bFGF 4.52±0.35 2.23±0.38

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。现代中医研究认为,气滞血瘀为其发生和发展的重要机制之一。研究表明肾上腺素多次小剂量皮下注射模拟长期肝气不疏,气滞不能行血,导致裸鼠全血黏度增高,血液处于黏、稠状态,形成血瘀证。[1]研究发现,肿瘤细胞生长的高代谢需求导致微环境出现缺氧,而血瘀证的病理基础是血液凝固—纤溶—血小板功能紊乱,[3]加重肿瘤细胞微环境缺氧的状态。缺氧诱导因子 （HIF-1）是细胞对于缺氧反应的最基本物质之一。它在恶性肿瘤中普遍存在,是缺氧诱导基因表达的中心调节因子,[4]表达受到缺氧、癌基因和抑癌基因、生长因子等多种因子的调节,可调控有关肿瘤血管生成、能量代谢等多种靶基因的转录、促进肿瘤生长、浸润和转移。

H IF-1属于 bHLH-PAS家族成员,是由 α亚单位（HIF-1α）和 β亚单位 （HIF-1β）组成的异源二聚体蛋白[5]。HIF-1β是许多bHLH蛋白的共同亚单位,不受氧水平的影响,在正常细胞和缺氧细胞的胞质和胞核中均有表达;HIF-1α是唯一的氧调节亚单位,在常氧条件下,细胞虽不断的合成 HIF-1α,但经 pVHL的介导而被泛素 -蛋白酶体系统迅速降解;在缺氧状态下,由于不发生自身羟基化降解被阻止,转入核内与HIF-1β结合形成有活性的HIF-1,HIF-1通过与其靶基因的启动子或增强子的缺氧反应元件结合而发挥其转录活性,从而调节肿瘤细胞的缺氧效应。研究发现,大多数实体瘤 HIF-1蛋白高表达,如直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、脑肿瘤、肾脏肿瘤等,而在相邻的正常组织或基质细胞中均不能测及。H IF-1的表达程度与肿瘤的恶性程度、新生血管的表达程度、肿瘤的侵袭能力及预后不良成正相关。

恶性肿瘤在发生、发展及转移的过程中,新生血管形成及对缺氧的耐受性是至关重要的。H IF-1通过与有关肿瘤血管形成的基因结合,使其表达升高,VEGF和 bFGF在肿瘤新生血管形成中起关键作用。VEGF是最重要的促进肿瘤血管形成的因子,分为 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子 （PGF）,VEGF在正常成人组织呈低水平表达,但在肿瘤组织中呈高表达。VEGF结合受体FLt-1和KDR,直接诱导内皮细胞增殖、迁移,增加血管通透性,促使血浆纤维蛋白外渗,增加血管外纤维性凝胶从而支持内皮细胞生长,有利于血管生成。[6]bFGF是目前已知最强的促血管形成因子之一,与细胞膜上受体结合,刺激内皮细胞产生血浆素原激活物和胶原酶,降解血管基底膜;诱导血管内皮长入胶原基质中,形成和毛细血管类似的管腔;刺激平滑肌增殖,使新生血管成熟。

血瘀证与恶性肿瘤存在密切关系,研究表明,肿瘤血瘀证主要与肿瘤患者的微循环障碍,高凝状态,血小板功能紊乱相关,同时与肿瘤新生血管等肿瘤微环境也存在重要关系。经过长期中医药对肿瘤治疗的临床研究,发现活血化瘀药物在防治肿瘤中起积极作用,通过影响血瘀证本质即通过调节肿瘤患者血液凝固状态 -纤溶 -血小板的平衡,特别是可能抑制肿瘤血管生成而发挥其药效。本实验结果显示麝香酮对肿瘤新生血管生成有明显的抑制作用。麝香酮是麝香的主要活性成分,具有芳香行气、通经活络、对抗缺氧损伤的功能。麝香酮通过芳香行气的作用,活血化瘀,改善血液的 “高凝状态”,降低血小板黏附、聚集,改善纤维蛋白含量,增加纤维蛋白溶解及血流量,[7]改善肿瘤细胞微环境缺氧的状态,使 HIF-1低表达,进而,VEGF和 bFGF表达减少,从而发挥抑制肿瘤新生血管生成的作用。目前麝香酮能抑制肿瘤的新生血管生成文献报道较少。故这一重要研究结论预示麝香酮在抑制肿瘤新生血管生成中具有较好的应用前景。

[1] 和岚,蒋文跃,毛腾敏.注射肾上腺素模拟 “气滞”复制急、慢性血瘀模型初探 [J].中国中西医结合杂志,2004,24（3）:244-245

[2] 左朝辉,黎祖荣,周晓.环氧合酶 -2抑制剂塞来昔布对人肝癌 HepG2裸小鼠移植瘤生长和肿瘤血管生成的抑制作用[J].癌症,2006,25（4）:414-420

[3] 刘永惠,杨晓峰,周冬枝 .肿瘤血瘀证实质及活血化瘀治则的研究 [J].河北中医,2002,24（4）:252-254

[4] 王敬俭,李静,耿美玉.靶向缺氧诱导因子 -1的抗肿瘤药物研究进展 [J].药学学报,2008,43（6）:565-569

[5] 朱小康,韩福生.缺氧诱导因子 -1在恶性肿瘤发生、发展和治疗中的作用 [J].蚌埠医学院学报,2010,35（2）:211-214

[6] 廖子君,雷光焰.肿瘤转移学 [M].西安:陕西科学技术出版社,2007.165-171

[7] 刘永惠,邓景元,邹鹏 .张玉五教授治疗肿瘤学术思想探究 [J].河北中医药学报,2006,21（4）:31-33

（2011-04-22 收稿）