针刺对糖尿病周围神经病变大鼠尾神经超微结构的影响

，， ， ，

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.吉林大学第一医院，吉林 长春 130021)

糖尿病是一种常见多发的慢性代谢性疾病，是全世界患病率最高的疾病之一，仅次于肿瘤和心血管疾病。糖尿病伴发慢性并发症的状况亦十分严重，其中以神经病变的发病率为最高，且发病较早，甚至隐性糖尿病既有周围神经病变，已成为糖尿病患者致残的主要原因。目前，现代医学治疗DPN尚无确切有效的方法，而中医针灸治疗该病显示出一定的优势。本课题组前期研究显示，早期针刺治疗能够明显改善DPN大鼠神经电生理指标[1]。为进一步验证针刺治疗DPN作用机制，采用透射电镜的方法观察针刺对实验性DPN大鼠尾神经超微结构的影响。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及试剂 超薄切片机(LKB-Ⅲ型，LEICA公司，日本)，透射电子显微镜(2000型，JEM公司，日本)，图像分析仪(V3.3，Tiger公司，美国)。

1.2 实验试剂及药物 STZ(Sigma公司)；0.1 mol/L柠檬酸缓冲液，4%多聚甲醛，2.5%戊二醛，10%水合氯醛(吉林大学基础医学院病理教研室提供)。

1.3 实验动物 雄性Wistar大鼠，6～8周龄，体质量180～220 g。

1.4 实验动物分组 90只Wistar雄性大鼠随机分为5组，正常对照组、糖尿病组、西药对照组、针刺治疗1组(DM大鼠成模后1个月开始给药)和针刺治疗2组(DM成模后2个月开始给药)。正常对照组10只，其余每组各20只。

1.5 动物制模方法 大鼠禁食不禁水24 h后，用STZ溶于0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)配制成浓度为1%的溶液，以60 mg/kg剂量给大鼠单次腹腔注射，对照组以等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射，平行进行实验。72 h后尾静脉采血测血糖，血糖高于16.7 mmol/L的大鼠入选糖尿病大鼠模型[2]。

1.6 治疗方法 造模成功后，西药组：成模1个月后，每日喂服弥可保，剂量为15 μg/次，治疗4周。针刺1组：成模后1个月开始治疗，选肺俞、脾俞、肾俞、三阴交、合谷、足三里6个穴位，隔日针刺1次，采用平补平泻法，针上通电，疏密波，中等强度刺激，每次30 min，治疗4周；针刺2组：成模后2个月开始治疗，方法同针刺1组。大鼠腧穴定位参照《实验针灸学》(中国中医药出版社，2003年)。

1.7 时间点 对照组和糖尿病组分别在造模成功后8周、12周处死部分大鼠取材。西药组、针刺组分别在治疗结束后取材。

1.8 电镜标本的制备 动物处死后，分离切除尾神经约1 cm长，用2.5%戊二醛固定，并置4 ℃冰箱中前固定，4 h后0.05 mol/L磷酸缓冲液，再以1%锇酸固定，氧化丙稀透明，Epon812包埋，超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，用JEM-2000型透射电镜观察单个神经纤维结构并选取适当放大倍数摄片。

2 结果

正常对照组可见粗细不等的有髓神经纤维和无髓神经纤维(见图1)，髓鞘板层规则排列髓鞘结构完整致密、均匀规则(见图2)，有髓神经纤维轴膜清晰，轴索较粗，轴浆内可见神经丝，线粒体无肿胀(见图3)。

糖尿病模型组8周时可见部分有髓神经纤维出现轻度脱髓鞘改变，并可见无髓神经纤维数量减少，髓鞘板层疏松分离并脱髓鞘(见图4)。12周时部分有髓神经纤维发生沃勒变性，轴索消失，髓鞘板层疏松呈不规则的膜样团块，多见较粗的有髓神经纤维受累严重。神经膜细胞和神经内膜无明显改变(见图5)。

针刺治疗1组与糖尿病组8周时比较，上述改变均减轻，有些神经纤维仍可见局部的板层分离现象。同时可观察到无髓神经纤维数量增多，轴索较正常对照组变细且部分仍呈不规则形状，轴浆内神经丝增多，偶见线粒体肿胀(见图6)。

针刺治疗2组可见髓鞘板层疏松，轻度脱髓鞘改变，形状不规则，无髓神经纤维可见。较糖尿病组12周时有明显改善(见图7)。

西药对照组可见部分有髓神经纤维轻度脱髓鞘改变，无髓神经纤维数量少于对照组，优于糖尿病组8周，轴索粗细不等，部分轴索呈不规则形，轴浆内神经丝较针刺2组增多，偶见线粒体肿胀(见图8)。

图1 对照组尾神经(×7 500)

图2 对照组尾神经(×10 000)

图3 对照组尾神经(×10 000)

图4 糖尿病组尾神经8周(×10 000)

图5 糖尿病组尾神经12周(×7 500)

图6 治疗1组尾神经(×7 500)

图7 治疗2组尾神经(×10 000)

图8 西药组尾神经(×7 500)

3 讨论

DPN的主要病理改变表现为周围神经的脱髓鞘和(或)轴索变性。这些改变既影响有髓纤维，也影响无髓纤维[3]。但是髓鞘受累在先或轴索病变在先则有不少争论。很多实验[4]证实，STZ诱导大鼠糖尿病成模后1～2个月就可观察到与人类DPN相似的病理改变。本实验对DPN大鼠的尾神经超微结构进行观察，结果发现了典型的神经纤维病变，这与学术界公认的STZ所致DM大鼠于造模后12周出现明显的周围神经病变的观点相符合[5]。本实验结果表明DPN早期以脱髓鞘为主要病理改变，且小的无髓神经纤维也同时受累。尾神经病理改变随时间加重，这与临床上DPN呈渐进性的表现一致。

目前西药对于DPN的治疗尚无特异性的方法。但针刺治疗DPN具有广泛临床报道，疗效肯定，无毒副作用。本课题采用整体调节针刺治疗方法，针对上、中、下三消的症状，选取肺俞以清热润肺、生津止渴,脾俞以补益气血、养阴生津,肾俞以补肾滋阴;3穴均为背俞穴，在神经节段上离所调节的脏腑最近，起到培本固元，滋阴生津的作用。另取上肢穴位合谷，下肢穴位足三里、三阴交，以疏调经络，接通阴阳，补益气血，诸穴合用，起到滋阴壮元，通调经络的作用。实验证实，针刺对DPN大鼠的周围神经有髓纤维的形态及功能具有肯定的恢复作用，且早期治疗优于晚期治疗；针刺治疗优于单纯西药治疗。

[1]逄紫千,王朝辉,朱丹,等.早期针刺干预对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经电生理的影响[J].吉林中医药,2010,30(9):808-810.

[2]于德民,吴锐,尹潍,等.实验性链脲佐菌素糖尿病动物模型的研究[J].中国糖尿病杂志,1995,3:105-109.

[3]刘明生,胡蓓蕾,崔丽英,等.糖尿病周围神经病700例临床与神经电生理分析[J].中华内科杂志,2005,44(3):173-176.

[4]Yagihashi S,Kamijo M,Watanabe K.Reduced myelinated fiber size correlates with loss of axonal neurofilaments in peripheral nerve of chronically streptozotocin diabetic rats[J].Am J Pathol,1990,136:1365-1373.

[5]钟学礼.临床糖尿病学[M].上海:上海科学技术出版社,1989:242.