白毛藤多糖抑制人卵巢癌细胞增殖作用及其机制研究

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(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

白毛藤(Solanum lyratum Thunb),又名白英，是茄科植物，具有清热、解毒、利湿、消肿等作用[1]。临床上用于多种肿瘤的治疗,是传统抗癌中药之一，已有实验[2-3]证实，其水提物有体外抑制细胞增殖的作用，但具体的抗癌成分并不明确，限制了其进一步的开发利用。本研究观察白毛藤中多糖成分对人卵巢癌细胞体外抑制作用，并初步从分子生物学角度探讨其作用机制，为筛选白毛藤中有效抗癌成分提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人卵巢癌SKOV3细胞株购自武汉中美科技有限公司。

1.1.2 药物、试剂与仪器 白毛藤多糖溶液由牡丹江医学院中心实验室提供。MTT试剂购自泰伦生物科技有限公司(批号041025)；Trizol购自Sigma公司(批号15596-018);荧光显微镜(CKX41-F32FL，奥林巴斯)，550型酶标仪(美国BIO-BAD公司产品)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 1%青霉素、链霉素，10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,37 ℃、5%CO2孵箱中培养。实验组：0.4、0.8、1.6 mg/mL的白毛藤多糖溶液。对照组：含SKOV3细胞的培养液。

1.2.2 MTT实验 收集对数生长期细胞调整浓度为1×105个/mL，接种100 μL/每孔,每个剂量设12个平行孔，分别培养12、24、48 h，加入5 g/L四甲基唑氮蓝(MTT)20 μL继续孵育；4 h后，弃上清,加入DMSO 150 μL，完全显色后，采用酶标仪测定各孔490 nm处吸光度(OD)值。按下列公式计算细胞生长抑制率(inhibition rate,IR)。IR=(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。

1.2.3 细胞凋亡检测 胰蛋白酶消化指数生长期的癌细胞。调整细胞密度为3×105/mL，接种于6孔板中1 mL/每孔。加入不同浓度白毛藤多糖，48 h后用胰酶消化细胞，冷PBS(pH 7.2)洗3遍，固定液4 ℃固定，10 min后弃固定液，蒸馏水洗3遍，室温干燥，用5 mg/L Hoechst33258染色15 min，置于荧光显微镜上观察细胞形态并计算细胞凋亡率。

1.2.4 RT-PCR 检测bcl-2、caspase-3mRNA表达 见表1。

表1 参考Trozol试剂盒提取细胞总RNA，按RT-PCR试剂盒操作提取cDNA设计引物表

2 结果

2.1 各组SKOV3细胞增殖抑制率比较 见表1。

表1 各组SKOV3细胞生长抑制率比较 mg/mL

2.2 荧光显微镜检测细胞凋亡情况 见表2。

2.3 各组bc1-2和caspase-3基因表达比较 见表2，图1，图2。

表2 白毛藤多糖对SKOV3细胞凋亡及基因表达影响 mg/mL

图1 各组细胞bcl-2基因表达

图2 各组细胞caspase-3基因表达

3 讨论

肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，现已证明其与细胞凋亡的关系密切相关。凋亡细胞的减少可引起肿瘤的发生，逃避细胞凋亡这种死亡方式可引起突变基因继续存在，导致细胞恶变。细胞凋亡又称为程序性细胞死亡(Programed cell death,PCD)，是在一种受基因调控的细胞主动死亡过程。细胞凋亡涉及多基因，其中bcl基因家族是重要的凋亡调控基因,包括两类：一类是促凋亡基因，如bak、bcl-xs;另一类是抑凋亡基因，如bcl-xl、bcl-2等。其中bcl-2基因是一种凋亡抑制基因，位于18q21，其编码蛋白只有与调节蛋白Bax形成二聚体时才有活性，当Bc1-2/Bax比率高时，Bcl-2抑制细胞凋亡[4]。bc1-2基因可以稳定线粒体膜,抑制caspase-3的激活，使细胞免于凋亡[5-6]。caspase-3是细胞凋亡信号转导通路中的ICE蛋白酶家族的成员，caspase-3被凋亡信号启动后，才能转变为成熟的酶，并酶切其特异的底物，通过影响特定信号分子参与细胞凋亡，许多肿瘤治疗是通过caspase-3途径介导的[7-8]。caspase-3的活化是DNA片段化及染色质凝聚等凋亡形态所必需的。

本研究观察白毛藤中多糖成分对人卵巢癌细胞是否具有诱导凋亡及抑制细胞增殖的作用，通过检测重要的凋亡调控基因探讨其抗癌作用机制。结果显示：1)白毛藤多糖抑制人卵巢癌细胞增殖，时间越长,浓度越大,抑制作用越明显；2)白毛藤多糖可以明显上调caspase-3基因mRNA表达，降低bcl-2基因mRNA表达；3)白毛藤多糖使人卵巢癌细胞凋亡数增加。据此结果，可以推断白毛藤多糖正因为上调caspase-3基因mRNA表达、降低bcl-2基因mRNA表达实现了抗人卵巢癌细胞增殖及促进凋亡作用，但在实验动物体内是否具有上述作用等等问题，还有待于进一步证实。

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