全脑照射后血脑屏障改变对放射性脑损伤的影响☆

阮林韦力廉春蓉张文佳莫立根李小妹

·论 著·

全脑照射后血脑屏障改变对放射性脑损伤的影响☆

阮林*韦力△廉春蓉△张文佳△莫立根※李小妹※

目的 探讨全脑照射后血脑屏障通透性的改变对放射性脑损伤的影响。方法 80只昆明小鼠随机分对照组、5 Gy、15 Gy和30 Gy剂量组，每组20只，分别于照射后1周和4周，各组随机取出10只小鼠采用Morris水迷宫测试其空间记忆能力，行为测试结束后，随机抽取7只测量其脑内伊文思蓝的含量，3只在电镜下观察血脑屏障结构的改变。结果 照射后1周，15 Gy和30 Gy剂量组脑内依文思蓝明显升高；照射后 4周，15 Gy剂量组恢复到对照组水平，而30 Gy剂量组仍未见恢复。照射后1周，15 Gy和30 Gy剂量组小鼠第1次穿越平台的时间延长和穿越次数明显减少；照射后4周，15 Gy剂量组恢复到对照组水平，而30 Gy剂量组仍未见恢复。电镜结果显示15 Gy剂量组照射后1周血脑屏障基膜周围出现透亮区，照射后4周恢复；30 Gy剂量组照射后1周血脑屏障基膜周围也出现透亮区，而照射后4周除血脑屏障基膜继续透亮区外，尚出现内皮细胞核固缩、神经元凋亡和脱髓鞘等现象。结论 放射后血脑屏障的通透性的改变是放射损伤的结果，可能也是放射后继发性脑损伤的原因。

放射性脑损伤 血脑屏障 伊文思蓝 超微结构

放射治疗是治疗鼻咽癌等头颈部恶性肿瘤的有效手段，而放射性脑损伤 （radiation encephalophathy，REP）则是放射治疗后严重的并发症之一，其发病机制尚未清楚。有报道放射可以影响血脑屏障（blood brain barrier，BBB）通透性［1－2］。然而，放射后BBB通透性改变对REP影响如何，尚未明确，故本实验通过观察放射后小鼠BBB通透性及其学习记忆能力改变来探讨放射后BBB在REP的发生和发展的作用，为有效防治放射性脑损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及动物模型的建立

1.1.1 实验动物及分组 雄性昆明小鼠80只 （由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物机构许可证号：SCXK桂2003－0003），2月龄，体质量25～30 g。采取随机化原则将小鼠分为对照组（0 Gy照射）、5 Gy剂量组、15 Gy剂量组和30 Gy剂量组共4组，每组20只，观察时间分别为照射后1周和4周。昼夜交替环境下饲养，自由摄食和饮水。

1.1.2 REP动物模型的建立 利用放疗定位膜在65～70℃热水中可软化和冷却后变硬的特点，按照小鼠的体型制作“放疗定位膜固定罩”。照射前将小鼠俯卧于固定罩下，头位固定，使小鼠不能转动或移位，待60 Co对线对位后，制做铅模，照射野上界位于双眼后眦连线，下界位于双耳后连线，避开口腔、鼻腔和双眼。5、15和30 Gy剂量组小鼠分别予5 Gy、15 Gy和30 Gy照射，剂量率为1250 cGy·min－1，照射源与体表距离为80 cm。对照组固定后放于相似的条件下，但不予照射。

1.2 Morris水迷宫神经行为学测试

1.2.1 水迷宫装置（中国医医学科学院药物研究所提供） Morris水迷由圆形水池、平台以及记录装置三部分组成。水池用不锈钢板制成，直径1 m，高50 cm，厚3 mm。池壁上等距离标记东、南、西、北四个入水点，东西及南北两点连线将水池等分为4个象限，分别称SW、NW、SE及NE象限，将一个直径为10 cm、高为28 cm的圆柱形平台固定放置于SW象限的中心位置上，平台顶部没于水面下1 cm，水温恒定，保持在（25±1）℃之间。池壁、池底及平台均用黑色胶纸粘贴，水颜色染为黑色，以达到隐蔽平台的目的。记录分析装置由摄像装置（悬挂于水池正上方约2 m处）和电脑分析系统组成。测试期间，周围环境以及水迷宫池壁上的参照物均保持不变，并保持室内安静。

1.2.2 测试过程 测试前1 d，为了减少应激反应对实验结果的影响，各组实验小鼠在学习训练前均被放逐于除去平台的Morris水迷宫约1 min，以熟悉环境降低应激反应，适应活动结束后将平台放回原处。各组小鼠训练时间分3段进行：照射前1周，照射后第4、5、6 d及照射后第26、27、28 d，于每天上午9：00至下午17：00进行。每日的训练中，小鼠被连续测试4次，分别从东、南、西、北4个象限入水，入水时动物面向池壁，小鼠找到并爬上平台后允许其在平台上休息15 s，然后再进行下一次测试，如小鼠在60 s内未能找到平台则由实验者将其引导到平台上，休息15 s。空间记忆测试：分别于照射前1周，照射后1周和4周结束训练后第2 d进行，撤除平台，NE象限为入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录其在120 s内第1次穿过平台位置的时间、穿越平台的次数、游泳速度和空间探索策略（即游泳轨迹）。

1.3 脑组织EB测定

1.3.1 标准曲线制作 称取4.0 mg伊文思蓝于容量瓶中，加生理盐水至总体积25 mL，取0.3 mL于试管中，加入5.7 mL甲酰胺混匀作为第1管，从第1管取3 mL加入3 mL甲酰胺作为第2管，从第2管取3 mL加入3 mL甲酰胺作为第3管，照此类共做 8管， 其浓度依次为 8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625（μg／mL）。置于37℃水浴箱72 h，以甲酰胺作为空白对照管，用722N可见分光光度计在EB最大吸收峰（620 nm）处测定各浓度（X值）EB溶液的吸光度（Y值），根据所测数值计算出回归方程：Y＝－0.006＋20.134 X。

1.3.2 测试过程 于放射后1周和4周神经行为测试结束后进行，各组随机抽取7只小鼠，尾静脉注射2%EB-NS（2 mg／kg）（sigma公司），存活3 h后，麻醉，经心脏灌注生理盐水直至流出清亮的液体为准。断头，冰盘取脑组织用电子天平精确称其湿重后，放入盛有3 mL的甲酰胺的试管中，37℃水浴72 h，1500 r／min离心15 min，取上清液，用722 N可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）在EB最大吸收光谱620 nm处测吸光度，根据所测得的吸光度在绘制的标准曲线上查得EB浓度。代入下列公式，计算每克脑组织中EB的含量。脑组织EB含μg／g＝EB浓度（μg／mL）×3 mL（甲酰胺体积）／脑组织重量（g）。

1.4 电镜观察 于放射后1周和4周神经行为测试结束后进行，各组随机抽取3只小鼠，以3.5%水合氯醛（350 mg／kg）腹腔注射麻醉后，经左心室主动脉先用生理盐水50 mL快速冲洗，继用2%多聚甲醛－2%戊二醛（pH 7.4）250 mL灌注固定，灌毕立即取脑浸于2%多聚甲醛－2%戊二醛（pH 7.4）中后固定4～6 h，在脑立体定位仪下取出小鼠前囟后3.54～4.54 mm侧脑室背外侧角处脑组织块，按常规方法制备超薄切片，在H-500型透视电镜（日本日立公司）观察。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0进行统计学处理，进行单因素方差分析（ANOVA），两两比较用LSD法检验，以双侧α＝0.05为显著性水准。

2 结果

2.1 空间探索性实验 随着训练次数增加，各组小鼠找到平台时间越来越短，空间探索策略也由边缘式转向随机式、趋向式和直线式，第一次穿越平台的时间逐渐减少和穿越平台的次数也逐渐增加（见表1、2和图1、2）。此外，从表1、2和图1、2尚可知，在照射前，各组小鼠空间探索策略、穿越平台次数和第一次穿越平台时间无明显差别，但在照射后1周，与对照组相比，15 Gy和30 Gy剂量组小鼠不仅穿越平台次数明显也减少（P＜0.05），第1次穿越平台时间明显延长（P＜0.05），而且其空间探索策略也恢复为边缘式或随机式；照射后4周，15 Gy剂量组小鼠空间探索策略、穿越平台次数和第1次穿越平台时间恢复到对照组水平，但30 Gy剂量组小鼠空间探索策略仍为边缘式或随机式，并且第1次穿越平台时间和穿越平台的次数仍未见恢复到对照组水平。5 Gy剂量组小鼠仅见在照射后1周空间探索策略出现改变，其他观察指标未见与对照组有明显差别。在训练和测试等各阶段，各组小鼠平均游泳速度无明显差别（P＞0.05）。

2.2 脑组织伊文思蓝含量的测试结果 各组小鼠脑组织EB含量的测定进行统计结果见表3。从表3可知，与对照组相比，照射后1周，15 Gy和30 Gy剂量组脑组织EB含量增加（P＜0.05），其中30 Gy剂量组增加更为明显（P＜0.01）。照射后4周，除30 Gy剂量组脑组织EB含量明显增多外，其余各组未见明显改变（P＞0.05）。

表1 各组小鼠照射前、后第1次穿越平台的时间（s）

表2 各组小鼠照射前后穿越平台的次数

图1 照射后1周各组游泳轨迹 对照组 （A），5 Gy剂量组（B），15 Gy剂量组（C），30 Gy剂量组（D）

图2 照射后4周各组游泳轨迹 对照组 （A1），5 Gy剂量组（B1），15 Gy剂量组（C1），30 Gy剂量组（D1）

表3 照射后不同时期脑组织EB含量（μg／g）的比较

图3 照射后1周各组小鼠血脑屏障变化 对照组（A），5 Gy剂量组（B），15 Gy剂量组（C），30 Gy剂量组（D）（4800×，bar＝1 μm）

图4 照射后4周各组小鼠血脑屏障变化 对照组（A），5 Gy剂量组（B），15 Gy剂量组（C），30 Gy剂量组（D）（4800×，bar＝1 μm）

2.3 电镜观察结果 对照组毛细血管管腔规则、内皮细胞形态正常、结构完整，厚度适中，内皮细胞间有紧密连接，毛细血管基膜薄而均匀，基膜外有星形胶质细胞足板围绕，其胞质染色均匀。照射后1周，5 Gy剂量组可见内皮细胞胞质内吞饮小泡增多，15 Gy和30 Gy剂量组毛细血管形态不规则，厚薄不等，在基膜周围出现透亮区（见图3）；照射后4周，5 Gy和15 Gy剂量组的形态结构恢复到对照组水平，而30 Gy剂量组形态结构改变不仅没有恢复，而且尚可见内皮细胞核固缩，神经元染色体浓缩或边集，胶质细胞肿胀和脱髓鞘等病理性改变（见图4）。

3 讨论

BBB是脑与血液及脑脊液之间的一种屏障，能控制血脑两侧的物质转运，对维持中枢神经系统内环境的相对稳定起到重要作用。正常情况下，EB不能透过BBB，在脑损伤时BBB通透性增高，EB则可通过BBB，因此脑组织EB含量值越大提示BBB通透性越高。本课题采用EB作为示踪剂，结果发现15 Gy和30 Gy剂量照射后1周脑组织EB含量明显高于对照组，同步电镜下也观察到其血脑屏障结构出现病理性改变，与文献报道一致［1－2］，不仅提示放射对BBB功能有损伤作用，同时也提示放射对BBB结构有损伤作用。学习记忆能力下降是放射性脑损伤最主要的临床表现［3－4］，本课题组通过Morris水迷宫进行检测放射后小鼠学习记忆能力等脑功能的改变，也印证上述观点，即15 Gy和30 Gy剂量照射后1周小鼠穿越平台次数下降和第一穿越平台时间延长；然而照射后4周15 Gy学习记忆能力恢复到对照组水平，而30 Gy学习记忆能力仍出现进行性损伤。有报道BBB的破坏是引发一系列脑组织损伤的关键因素，是脑源性疾病发生、发展的重要原因之一［5－6］。本课题组进一步研究发现，30 Gy剂量照射后4周，小鼠学习记忆力出现进行性损伤，其BBB结构和功能也出现明显损伤，而15 Gy剂量照射后4周，BBB结构和功能恢复到对照组水平，空间记忆能力自行恢复到对照组水平，这结果不仅印证上述观点，同时提示大剂量照射或小剂量的反复照射造成BBB持续开发或损失，可以造成放射后脑组织的继发损伤，这较好解释临床上全脑放疗后部分脑损伤能自行恢复，而有些为不可逆和进行性等［7－8］现象，但其机制有待进一步探讨。无疑，放射后BBB开放既是放射损伤的结果，可能也是放射后脑组织继发性损伤的原因。因而，若能减轻放疗后BBB的损伤，有效地控制这一病理生理过程，对于放射性脑损伤的治疗及预后可能有重要临床意义。

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（责任编辑：李 立）

表1 酒精滥用大学生与对照组大学生TPQ纬度得分比较

据以往研究报道，高NS得分的个体常喜欢发展新兴趣，从事新活动，但易忽略细节，很快分心，或感到无聊，因此易产生物质滥用；HA反映了大脑的惩罚（或行为抑制）系统，低HA得分与青少年早期物质使用和酗酒有关；RD反映了促进获取条件化信号或奖赏或远离惩罚的大脑系统的变动，低RD得分大学生对言语赞许和社会强化的反应能力受损，且往往不能坚持某一行为，对现实生活中难以预测的挫折丝毫不能忍受。因此，习惯于使用物质来发泄情绪［5］。本研究结果支持既往三维人格的理论假设，提示高NS分／低HA分和低RD得分的个体更易发生成瘾行为，与台湾学者的观点一致，认为可对具有此类人格特点的具有家庭等其他风险因素的青少年进行必要的防成瘾干预［5］，这可能降低成瘾行为的发生率。

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The study on the relationship between permeability alteration of blood brain barrier and radiation brain injury after whole brain irradiation in rats.

RUAN Lin，WEI Li，LIAN Chunrong，ZHANG Wenjia，MO Ligen，LI Xiaomei.Department of Radiotherapy of the First Affiliated Hospital，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China.Tel：0771－5358854.

Objective To observe the effects of the changes of blood brain-barrier on radiation encephalophathy after whole brain irradiation.Methods Eighty mice were randomly divided into 4 groups：control group，5Gy-irradiated group，15Gy-irradiated group and 30Gy-irradiated group（20 mice in each group）.The ability of space memory was tested by using Morris Water Maze in 1 week and 4 weeks after irradiation respectively.The BBB permeability was evaluated by measuring the Evans Blue（EB）content of the brain and the ultrastructural changes of BBB was investigated under transmission electron microscope.Results One week after irradiation，the levels of brain EB were significantly higher in 15 and 30 Gy dose groups than in control group.Four weeks later，the levels of brain EB returned to control levels in 15 Gy group but remained unchanged in 30 Gy group.Similarly，the time for first platform cross was prolonged and the number of platform cross was reduced in 15 and 30 Gy groups one week after irradiation.the time for first platform cross and the number of platform cross returned to normal in 15 Gy group but remained unchanged in 30 Gy group four weeks after irradiation.Electron microscopy showed the translucent zone around the basement membrane of BBB in 15 and 30 Gy groups.The translucent zone returned to normal in 15 Gy group but still remained accompanying with endothelial cell shrinkage，neuronal apoptosis and demyelination in 30 Gy group.Conclusions The alteration of BBB permeability after radiation change may result from primary radiation injury or may be the cause of secondary radiation-induced brain injury.

Radiation encephalophathy（REP） Blood-brain barrier（BBB） Evans Blue（EB） Ultrastructure

R743

A

2010－10－20）

R749.6 （

2011－07－20）【文献标识码】A （责任编辑：曹莉萍）

☆ 广西青年基金项目（编号：0640038），广西科学基金项目（编号：0342038）

* 广西医科大学第一附属医院放疗科（南宁 530021）

△ 广西医科大学解剖学教研室

（E-mail：wei＿lm＠yahoo.com.cn）

※ 广西医科大学肿瘤医院头颈外科