灰树花多糖联合顺铂对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的影响

吕冬霞,杜 伟,范晓艳,张晓波

(佳木斯大学基础医学院生物学教研室,黑龙江佳木斯 154007)

细胞凋亡作为当今生物医学研究中最引人注目的领域之一,正以惊人的速度取得令人瞩目的进展。研究显示灰树花多糖可减少化学疗法的副作用。顺铂是目前应用最广泛的化疗药物之一,本研究通过测定肿瘤抑制率、HE染色和免疫组化检测Caspase-3的表达,探讨灰树花多糖联合顺铂对肿瘤细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

瘤株:H22肝癌细胞购于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院动物中心;实验动物:昆明种近交系小鼠,体重(20±2.0)g,雄性,佳木斯大学实验动物中心提供,许可证号:黑动字第99101001,普通级,普通环境饲养。灰树花多糖粉末(浙江方格药业有限公司,多糖含量90%)。顺铂粉剂(山东齐鲁制药厂)。Caspase-3抗体(河北博海生物)。SP-9001试剂盒(北京中杉金桥)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立、分组与给药方式

40只昆明种小鼠各自接种1×107/mL细胞悬液于右侧腋下,随机分成4组,每组10只。24h,开始给药。给药时间为:每日早上进行灌胃一次,晚上进行腹腔注射一次,间隔时间12h,连续给药14d。具体给药方法见表1。

表1 实验动物的给药种类与用量

1.2.2 肿瘤抑制率

肿瘤抑制率(%)=(阴性组平均瘤重-给药组平均瘤重)/阴性组平均瘤重×100%。

1.2.3 HE染色

按说明书操作。

1.2.4 免疫组化

采用SP法。Caspase-3阳性为细胞膜和细胞浆着色。

1.3 统计分析

采用SPSS10.0统计软件进行数据统计分析,结果以均数±标准差表示。采用完全随机设计两样本均数比较t检验和方差分析,P＜0.05为有差异。

2 结果

2.1 肿瘤抑制率

表2 肿瘤抑制率(± s,n=10)

表2 肿瘤抑制率(± s,n=10)

注:与阴性组比较 * P＜0.05,**P＜0.01。

平均瘤重(g)___________肿瘤抑制率(%)阴性组 2.57±0.54 —灰树花多糖组 1.58±0.31* 38.52顺铂组 1.08±0.12* 57.98联合组 0.86±0.07** 66.54_______

2.2 HE染色

HE染色后在高倍镜下观察:阴性组的H22肿瘤细胞大小和形态很不一致,呈多形性,棱形或多边形铺层生长,可观察到瘤巨细胞。细胞核的体积增大,核质比增高。出现巨核、双核、多核或奇异形核。核仁明显,体积大,数目增多,核分裂相增多,出现异常的核分裂相;各给药治疗组的H22肿瘤细胞与细胞间接触的消失,但细胞膜依然完整。染色质固缩,形成新月形帽状结构等形态,沿着核膜分布。可见凋亡小体的形成。

2.3 免疫组化

对免疫组化的片子进行显微镜观察,caspase-3为细胞膜和细胞浆着色。采用免疫组化评分法,由2名观察者对切片盲式阅片,显微镜下随机选择5个高倍镜视野(×400),观察所选择视野中的所有细胞,记录阳性染色细胞百分数并计分。评分标准如下:

A为阳性细胞数分级0～1%=0;1%～10%=1;10%～50%=2;50%～80%=3;80%～100%=4。

B为阳性细胞显色强度分级 0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性)。

IHS=A×B

对所得数值进行完全随机设计两样本均数比较t检验。

表3 小鼠实体瘤caspase-3表达(± s,n=10)

表3 小鼠实体瘤caspase-3表达(± s,n=10)

注:与对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01。

_级别 caspase-3阴性组 0.5556±0.0182灰树花多糖组 1.0000±0.2042*顺铂组 1.8889±0.2936**_联合组 3.3333±0.6933*________________*

3 讨论

灰树花多糖是从灰树花子实体、菌丝体中提取的,具有增强免疫功能、抑制肿瘤、抗HIV病毒、稳定血压、降低血糖、改善脂肪代谢等广泛的生理活性[1]。有研究表明,PGF对体内S180肉瘤具有抑制作用[2]。通过HE染色在光镜下观察各组细胞形态,阴性组的H22肿瘤细胞呈棱形或多边形铺层生长,细胞分裂增殖活跃,多见分裂相;各给药组的H22肿瘤细胞表现出典型的细胞凋亡特征,说明顺铂和灰树花多糖均可诱导H22肿瘤细胞凋亡。Caspase被认为是细胞凋亡的核心执行者即凋亡的共同通路。Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路且位于该细胞级联反应的下游,它通过下游效应因子切断细胞间的信号传递,重组细胞骨架,关闭DNA复制和修复,破坏DNA和细胞核结构,诱导凋亡小体来执行凋亡功能[3]。本实验结果说明灰树花联合顺铂抑制肿瘤生长与促进Caspase-3高表达有关。通过本实验观察到,灰树花多糖组、顺铂组、联合组均对H22细胞具有杀伤作用,以联合组效果最明显。各治疗组均对肿瘤细胞有抑制作用,联合组最强,其次为顺铂组,再次为灰树花多糖组。联合组抑瘤效果最佳,且小鼠生命力旺盛,说明灰树花多糖对于顺铂有增敏作用,且明显。

本研究提示顺铂、灰树花多糖可以有效地抑制 H22肿瘤细胞的增殖,从而导致 H22肿瘤细胞大量凋亡。应用灰树花多糖联合顺铂具有一定的协同作用,在降低化疗药物毒副作用的同时有效诱导H22肿瘤细胞凋亡,提高综合治疗效果。综合考虑灰树花多糖的多种功效和高安全性,它具有可能成为肿瘤化疗辅助剂的巨大潜力。

[1]Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential[J].Altern Med Rev,2001,6(1):48-60

[2]杜景卫,夏作理,李清初,等.灰树花多糖抗S180肉瘤的实验研究[J].泰山医学院学报,2005,25(2):193-195

[3]Nicholson DW,Thornberry NA.Caspases:killer proteases[J].Trends Biochem Sci,1997,22(8):299-306