载铜纳米壳聚糖对断奶仔猪生长性能、免疫和抗氧化指标的影响

王敏奇 叶珊珊 杜勇杰 陶文静 谢小利

(浙江大学动物科学学院，动物分子营养学教育部重点实验室，杭州 310029)

载铜纳米壳聚糖对断奶仔猪生长性能、免疫和抗氧化指标的影响

王敏奇 叶珊珊 杜勇杰 陶文静 谢小利

(浙江大学动物科学学院，动物分子营养学教育部重点实验室，杭州 310029)

本试验旨在研究不同剂量载铜纳米壳聚糖(CNP-Cu)对断奶仔猪生长性能、免疫和抗氧化指标的影响。选择108头平均体重(7.20±0.81)kg的21日龄“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪，随机分成6组，每组3个重复，每个重复6头猪。对照组饲喂基础饲粮;抗生素组在基础饲粮中添加100 mg/kg金霉素;试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组在基础饲粮中分别添加50、100、150、200 mg/kg的CNP-Cu。试验期28 d。饲养试验结束后，前腔静脉采血制血清，测定免疫及抗氧化指标。结果表明:1)饲粮中添加CNP-Cu能提高仔猪平均日采食量和平均日增重，降低料重比，降低腹泻率，以100 mg/kg剂量组的作用效果最佳(P＜0.05);2)饲粮中添加CNP-Cu能显著提高断奶仔猪血清补体C3水平、谷胱甘肽过氧化物酶活性和总抗氧化能力(P＜0.05)。结果提示，饲粮中添加载铜纳米壳聚糖能提高断奶仔猪的免疫和抗氧化机能，提高生长性能，降低腹泻率，具有替代抗生素的潜在应用价值。

载铜纳米壳聚糖;断奶仔猪;生长性能;免疫;抗氧化指标

仔猪早期隔离断奶是规模化猪场提高母猪利用率的重要手段之一，但由此产生的“仔猪早期断奶应激”会导致断奶仔猪采食量下降，生长迟滞，腹泻率上升，生产性能大幅下降。为克服仔猪断奶应激，生产中往往在断奶仔猪饲料中添加大量抗生素。抗生素产生耐药性的负面作用早已引起社会广泛关注。在欧盟全面禁止在饲料中添加抗生素之后，我国对饲料中抗生素的使用也做出了严格的规定。研究开发新型安全的抗生素替代品也一直成为动物营养学界的研究热点之一。壳聚糖(chitosan，CS)是迄今为止惟一发现的阳离子动物纤维和碱性多糖，具有抗菌和提高机体免疫力的重要功能，被认为是一种新型畜禽促生长剂、免疫增强剂、消化道黏膜保护剂和广谱抗菌剂［1］。本课题组前期研究表明，壳聚糖纳米粒径化后表现出更高的抗菌性能［2］。在此基础上，本课题组在纳米壳聚糖上负载具杀菌功能的铜离子，研制成功了载铜纳米壳聚糖复合微粒(copper loaded chitosan nanoparticles，CNP-Cu)。体外研究发现，纳米壳聚糖在载铜后，杀菌能力大幅度增强，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度下降了10倍［2］。在大鼠上的研究表明，CNP-Cu可增强大鼠的免疫机能，显著提高血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白 G(IgG)、补体 C3和溶菌酶(LE)水平，改善大鼠生长性能［3］。但有关载铜纳米壳聚糖在断奶仔猪上的应用研究尚未见报道。因此，本研究以自行研制的CNP-Cu为试验材料，探讨其对断奶仔猪的生长、免疫及抗氧化机能的影响，旨在为饲用抗生素替代品的研究与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

CNP-Cu微粒由本课题组自制，实测平均粒径为772.4 nm，平均电荷为 63.62 mV，铜含量为1.504%;抗生素为15%的饲用金霉素(CTC)，购自武汉鑫华远科技发展有限公司。

选择108头体况良好，平均体重为(7.20±0.81)kg的21日龄“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪，随机分为6组，每组3个重复，每个重复6头猪，公母各占1/2。对照组饲喂基础饲粮;抗生素组在基础饲粮中添加100 mg/kg的饲用金霉素;试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组在基础饲粮中分别添加50、100、150、200 mg/kg 的 CNP-Cu。基础饲粮参照NRC(1998)断奶仔猪营养需要配制成粉状全价料，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Com position and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 饲养管理及待测指标

试验仔猪采用分栏群饲，自由采食和饮水，进行常规仔猪免疫程序，饲养管理按常规进行。试验前对猪舍常规进行消毒。预试期5 d，正试期28 d。试验期间每天记录饲料消耗量及腹泻状况。试验结束后，禁饲24 h后称重。计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)及腹泻率(diarrhoea rate)。

1.3 样品采集与保存

试验结束当天08:00，所有参试猪前腔静脉采血约 10 m L，3 000 r/m in离心 15 m in取血清，－70℃保存。采血前1天20:00停喂饲粮，使仔猪空腹12 h。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 血清免疫指标测定

血清 IgG、IgA、免疫球蛋白 M(IgM)，补体C3、C4的测定采用免疫浊度法，试剂盒购自上海复星长征医学科学有限公司，在RX daytonaTM全自动生化分析仪上测定;LE的测定采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒。

1.4.2 血清抗氧化指标测定

血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)的测定采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒。

1.5 数据处理与分析

所有试验数据均以平均值±标准差表示，采用SPSS 16.0统计软件对数据进行单因素方差分析，采用Duncan氏多重比较进行组间差异显著性检验，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 生长性能与腹泻率

由表2可见，断奶仔猪饲粮中添加不同剂量CNP-Cu均不同程度地改善了猪的生产性能，其中以100 mg/kg剂量组效果最佳，ADG、ADFI分别较对照组提高了 82.24%和29.76%(P＜0.05)，F/G 下降了28.82%(P＜0.05)，该组仔猪生产性能整体水平优于金霉素组，但未达显著水平(P＞0.05)。50 mg/kg剂量组猪的生产性能也有较好表现，ADG、ADFI分别较对照组提高了72.97%和27.04%(P＜0.05)，F/G 下降了 26.39%(P＜0.05)，与 金 霉 素 组 相 当。150 mg/kg 和200 mg/kg剂量组仔猪生产性能较对照组亦有改善，但低于50 mg/kg和100 mg/kg剂量组及金霉素组。结果可见，CNP-Cu对断奶仔猪生长性能的改善无剂量线性相关，本梯度试验表明，100 mg/kg为最佳剂量组。

断奶仔猪饲粮中添加不同剂量CNP-Cu具有不同程度的抗腹泻效果，以100 mg/kg剂量组最佳，仔猪腹泻率较对照组下降了29.84%(P＜0.05)，与金霉素组相当。

表2 CNP-Cu对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响Table 2 Effect of CNP-Cu on growth performance and diarrhea rate of weaned piglets

2.2 血清免疫指标

由表3可见，饲粮中添加不同剂量CNP-Cu对断奶仔猪血清免疫球蛋白有不同程度的提高，但未达到显著水平(P＞0.05)。此外，50、100和150 mg/kg剂量组血清补体C3水平分别较对照组提高了 42.86%、57.14% 和42.86%(P＜ 0.05)。血清LE含量以100 mg/kg剂量组最高，较对照组提高了 28.70%(P＜0.05)。

表3 CNP-Cu对断奶仔猪血清免疫指标的影响Table 3 Effect of CNP-Cu on serum immune indices of weaned piglets

2.3 血清抗氧化指标

由表4可见，饲粮中添加CNP-Cu均不同程度地提高了血清中 GSH-Px的活性，50、100、150和200 mg/kg剂量组分别较对照组提高了10.26%(P＜ 0.05)、7.12%(P＜ 0.05)、5.51%(P＞0.05)和8.55%(P＜0.05)。与对照组相比，50、100、150和200 mg/kg剂量组血清T-AOC分别提高了27.07%、33.70%、28.18% 和 24.31%(P＜0.05)。各组间SOD、CAT和POD活性未发现有显著差异(P＞0.05)。

表4 CNP－Cu对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响Table 4 Effect of CNP-Cu on serum antioxidant indices of weaned piglets

3 讨论

3.1 CNP-Cu对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响

Braude［4］首次发现饲粮中添加动物正常需要量10倍的铜，可明显提高动物的生长性能。铜离子已被证实具有体内抗菌的作用，铜离子复合体具有母体配体与无机铜离子所没有的显著药理学效应。研究发现，有机铜源(蛋氨酸铜、赖氨酸铜、酪蛋白铜等)的作用效果明显优于无机铜源(硫酸铜、氧化铜等)［5－8］。壳聚糖是迄今为止惟一发现的碱性多糖，在其复杂的空间结构中含有高活性的功能基团，表现出类抗生素的特性，能够抑制多种细菌的生长。壳聚糖纳米化后由于纳米粒子的特性而表现出更高的杀菌活性［9］。CNP-Cu是以壳聚糖和CuSO4为主要原料，运用纳米技术构建的可降解、无毒无害的聚合物，具有粒径小、表面电荷高等纳米粒子特殊的生物学特性，能够提高其在生物阳离子环境中的稳定性，并通过与负电性生物膜的互作和体内特异位点靶向作用提高其杀菌活性［2］。本试验结果显示，添加不同剂量CNP-Cu能提高断奶仔猪的 ADG、ADFI和 F/G，其中100 mg/kg剂量组的作用效果最显著。与抗生素金霉素组相比，添加100 mg/kg的CNP-Cu组在提高生长性能方面的效果也具一定优势，但差异未达到显著水平。这与课题组前期在大鼠上的研究相一致，与对照组相比，每天分别口服80和160 mg/kg BW的CNP-Cu能显著提高大鼠的ADG和 F/G［3］。剂量梯度饲养试验还发现，CNP-Cu对断奶仔猪生长性能的改善不存在剂量线性相关性，高剂量添加未出现生产性能的进一步的改善。这与常规壳聚糖在动物上应用的效果基本一致。目前，较多报道表明壳聚糖具有提高动物生长性能的作用［10－13］，但推荐的适宜添加量不同，总体表现为低剂量促生长而高剂量抑制生长。有关CNP-Cu的最适添加量及高剂量抑制生长的机理还有待进一步深入研究。

仔猪早期断奶易发生腹泻，饲粮中抗生素的使用能明显降低断奶仔猪的腹泻率［14－15］。本试验结果表明，饲粮中添加100 mg/kg的金霉素能显著降低断奶仔猪的腹泻率。添加不同剂量的CNP-Cu也能显著降低仔猪腹泻率，效果略低于抗生素组，但差异不显著。CNP-Cu具有很高的电动电位，更容易与带负电的菌体表面发生作用，因此表现出较高的杀菌活性，并通过破坏菌体细胞膜导致菌体内物质外泄而死亡［16］。前期对大鼠的研究表明，CNP-Cu有效抑制了肠道病原菌的生长和繁殖，降低了细菌酶活性，从而改善了肠黏膜形态结构和功能，有助于养分的充分消化和吸收利用［16］。这一点很好地解释了本试验中CNP-Cu能显著降低断奶仔猪的腹泻率的作用机理，揭示CNP-Cu具备替代抗生素的巨大潜力。

3.2 CNP-Cu对断奶仔猪血清免疫指标的影响

哺乳动物体内起免疫保护作用的主要是IgG、IgA和IgM 3种免疫球蛋白。补体具有协助、补充和加强抗体及吞噬细胞免疫活性的作用，在机体防御体系中起到协同抗感染的作用。LE能溶解细菌细胞壁，也能使病毒失活，还参与机体多种免疫反应，是反映巨噬细胞功能的标志酶，是细胞免疫能力高低的一项重要指标。本课题组前期对大鼠的研究发现，CNP-Cu能显著提高大鼠血清中IgA、IgG和LE的水平，补体C3的浓度也高于对照组，其作用效果优于壳聚糖［16］。本试验中未发现添加CNP-Cu对血清中3种免疫球蛋白含量产生显著影响，但血清补体C3和LE含量均显著高于对照组，尤以100 mg/kg剂量组效果最佳。研究认为，纳米微粒容易被人或动物的免疫系统识别并通过胃肠道淋巴结吸收，同时，纳米微粒还可延长免疫反应的时间，并诱发机体产生体液和细胞免疫反应［17］。

3.3 CNP-Cu对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

动物在应激状态下，机体抗氧化酶活性降低，消除氧化代谢产物的能力下降，从而导致体内自由基产生与清除的动态平衡被打破，自由基逐渐积累并产生氧化损伤。SOD、GSH-Px、CAT、POD等具有很强的清除活性氧和自由基的作用，可提高机体的抗氧化能力，是常用的抗氧化指标［18］。本试验发现，饲粮中添加不同剂量CNP-Cu均显著提高了血清GSH-Px活性和T-AOC。说明饲粮中添加CNP-Cu可改善断奶仔猪抗氧化能力，缓解应激造成的自由基对机体生物膜的破坏，从而提高机体免疫力和抗病能力。

4 结论

① CNP-Cu能显著提高断奶仔猪的生产性能，降低腹泻率，以100 mg/kg剂量组效果最佳。

② CNP-Cu可显著提高血清补体C3水平、GSH-Px活性及T-AOC。

③断奶仔猪饲粮中添加CNP-Cu能提高机体免疫力，增强抗氧化能力，从而产生抗断奶应激，改善生产性能的效果。

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Author，WANG Minqi，associate professor，E-mail:wangmq@zju.edu.cn

(编辑 武海龙)

Chitosan Nanoparticles Loaded Copper Ions A ffect G row th Performance，Imm unity and Antioxidant Indices of Weaned Piglets

WANG Minqi YE Shanshan DU Yongjie TAO Wenjing XIE Xiaoli
(College of Animal Science，Zhejiang University;Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition of Ministry of Education，Hangzhou310029，China)

The study was conducted to investigate the effect of dietary chitosan nanopartides loaded copper(CNP-Cu)on growth performance，immunity and antioxidant indices of weaned piglets.A total of 108 21-day-old threeway cross(Duroc×Landrace×Yorkshine)weaned pigletswith an initial average body weight of(7.20 ±0.81)kg were random ly assigned into 6 groupswith 3 replicates per group and 6 piglets per replicate.The piglets in control group were fed basal diet;Piglets in chlortetracycline(CTC)group were fed the basal diet supplemented with 100 mg/kg CTC，and piglets in four trial groups(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ andⅣ)were fed the basal diet supplemented with 50，100，150 and 200 mg/kg CNP-Cu，respectively.The experiment lasted for 28 days.A fter term ination of the feeding trial，blood sampleswere collected from anterior vena cava of all piglets for serum indices analysis.The results showed as follows:1)supplementation of CNP-Cu increased average daily feed intake and average daily gain，and decreased feed gain ratio and diarrhea rate，and the optimal supplemental level of CNP-Cu was 100 mg/kg(P＜0.05).2)Serum complement component3，glutathione peroxidase activity and total antioxidant capacity were significantly increased with the supplementation of CNP-Cu(P＜0.05).These results suggest that supplemental CNP-Cu has beneficial effects on immune and antioxidant function in weaned pigs，which also can increase growth performance and decrease diarrhea rate.Accordingly，CNP-Cu has a potential to substitute antibiotics.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(10):1806-1811］

CNP-Cu;weaned pigs;growth performance;immune;antioxidant

S828

A

1006-267X(2011)10-1806-06

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.10.022

2011－04－13

浙江省重大科技专项(2008C12048)

王敏奇(1972—)，男，浙江安吉人，博士，副研究员，主要从事动物营养与饲料科学研究。E-mail:wangmq@zju.edu.cn