自然霉变玉米对仔猪肠道微生态的影响

雷晓娅 陈代文 毛湘冰 毛 倩 陈 洪 张 玲 段绪东 余 冰

(四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养四川省重点实验室，雅安 625014)

自然霉变玉米对仔猪肠道微生态的影响

雷晓娅 陈代文 毛湘冰 毛 倩 陈 洪 张 玲 段绪东 余 冰*

(四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养四川省重点实验室，雅安 625014)

本试验旨在研究自然霉变玉米对仔猪生长性能、肠道形态和肠道微生物数量及其代谢产物的影响。15头35日龄的PIC仔猪按体重相近的原则随机分为3个处理，分别为对照组(饲喂玉米－豆粕型基础饲粮)、霉变玉米组(饲喂由自然霉变玉米100%替代基础饲粮中正常玉米的饲粮)和采食量配对组(饲喂基础饲粮，采食量与霉变玉米组相同)，每个处理5个重复，每个重复1头仔猪。试验期21 d。结果发现，在试验前2周，霉变玉米组仔猪的平均日增重和平均日采食量与对照组相比有降低的趋势(P＞0.05)，而全期平均日增重显著高于采食量配对组(P＜0.05)，料重比显著低于采食量配对组(P＜0.05)。霉变玉米组仔猪空肠绒毛高度与隐窝深度的比值显著低于对照组和采食量配对组(P＜0.05)，隐窝深度显著高于采食量配对组(P＜0.05)。霉变玉米组仔猪第2周末直肠中乙酸和总挥发性脂肪酸含量显著低于采食量配对组(P＜0.05)。霉变玉米组仔猪第3周末盲肠中大肠杆菌数、乳酸杆菌数和丙酸含量显著高于对照组(P＜0.05)，氨含量有提高的趋势(P＞0.05)。结果表明，自然霉变玉米可损伤仔猪空肠形态结构，提高仔猪盲肠中大肠杆菌数和乳酸杆菌数，改变仔猪肠道微生物区系，进而影响仔猪健康。

霉变玉米;仔猪;生长性能;肠道菌群;代谢产物

玉米等饲料原料在田间及贮运过程中均容易发生霉变，动物摄入含霉菌毒素的饲料后，会出现生产性能下降、胃肠道功能紊乱、机体氧化损伤、免疫抑制和抗病力减弱等毒性效应，给养猪业带来严重的危害。大量研究表明，霉菌毒素会降低动物的采食量和日增重［1－5］，同时，残留在动物产品中的霉菌毒素及其代谢产物可以通过食物链危害人类的健康［6－7］。胃肠道既是养分消化吸收的主要部位，也是抵御摄入天然毒素的第1道屏障。有研究表明，霉菌毒素会损伤动物肠道结构，降低养分消化吸收［8］。动物消化道内存在大量微生物，肠道微生物区系的平衡对于动物的健康起着非常重要的作用。但动物摄入被霉菌毒素污染的饲粮后，霉菌毒素对肠道微生物区系有什么样的影响，还未见报道。因此，本试验旨在从肠道形态结构和微生态环境变化2个方面考察自然霉变玉米对仔猪生长性能和肠道健康的影响，并通过采食量配对组的设定来进一步剖析效应产生的可能原因。

1 材料与方法

1.1 试验设计

15头35日龄的PIC仔猪按体重相近的原则随机分为3个处理，分别为对照组(饲喂正常玉米－豆粕型基础饲粮)、霉变玉米组(饲喂由自然霉变玉米100%替代基础饲粮中正常玉米的饲粮)和采食量配对组(饲喂基础饲粮，饲喂量与霉变玉米组相同)，每个处理5个重复，每个重复1头仔猪。试验期21 d。

霉变玉米为自然霉变所得，经检测主要为黄曲霉毒素B1(AFB1)污染，含量为216.52μg/kg;其营养成分为:粗蛋白质 12.42%、能量16.90 MJ/kg、钙 0.028 7% 和磷 0.302 7%。

1.2 试验饲粮

基础饲粮(玉米－豆粕型)参照美国 NRC(1998)5～10 kg仔猪的营养需要标准配制为粉料。基础饲粮组成及营养水平见表1。将基础饲粮中正常玉米用霉变玉米100%替代后构成霉变玉米组饲粮。

1.3 饲养管理

试猪饲养于代谢笼中，自由饮水，每天饲喂4次(08:00、12:00、16:00 和20:00)。每次以采食后料槽略有少量余料为度，采食量配对组每次均少量供给，推迟2 h等霉变玉米组采食完成后计算出采食量，再结算补给应给予的饲料量。试验期间每天记录采食量。猪舍温度控制在26～28℃。消毒按常规程序进行。

1.4 样品采集

1.4.1 饲料样品

按照国标(GB/T 14699.1—2005)《饲料采样法》的要求分别采集粉碎后的霉变玉米、正常玉米以及不同处理的饲粮各1 kg，再按照四分法将样品减少到200 g，于－20℃冰箱保存待测。

1.4.2 十二指肠和空肠

在试验第22天早上仔猪麻醉致死剖解后，分离肠道，用生理盐水冲洗干净，剪取十二指肠和空肠前段3～4 cm，放入10%中性福尔马林固定液中，待测肠绒毛形态结构。

1.4.3 后肠内容物

在试验第15天早上喂料后2 h，用无菌棉签刺激仔猪肛门，收集仔猪直肠内容物;在试验第22天喂料后2 h进行麻醉剖解，于冰面上收集盲肠和直肠内容物。所有内容物液氮速冻后转入－70℃冰箱贮存，待测肠道微生物数量及代谢产物含量。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 饲料中霉菌毒素含量

采用酶联免疫法测定霉变玉米和正常玉米以及各处理饲粮中黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的含量。按照ROMER试剂盒说明书进行测定。

表1 基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(as-fed basis) %

1.5.2 生长性能

试猪于试验起始、第15天和第22天早上空腹称重，计算各阶段平均日增重(ADG);每天结算采食量，计算各阶段平均日采食量(ADFI);根据平均日增重和平均日采食量计算料重比(F/G)。

1.5.3 肠道组织形态结构

将置于10%中性福尔马林固定液中的十二指肠和空肠组织经脱水、浸蜡、包埋和切片等处理，再经苏木精－伊红染色，在光学显微镜下进行观察。每个样品均选择8个典型的视野(绒毛完整及走向平直)测定十二指肠和空肠绒毛高度和隐窝深度，计算绒毛高度与隐窝深度比值。样品在四川农业大学病理实验室测定。

1.5.4 后肠内容物微生物数量

按照OMEGA试剂盒说明书提取盲肠和直肠内容物DNA，采用本试验室Qi等［9］建立的荧光定量PCR方法测定并计算盲肠和直肠中大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌以及总菌数量。各菌PCR引物和探针序列见表 2，PCR反应体系见表 3。SYBR Prem ix Ex Taq购自 TaKaRa，Real Master Mix(Probe)购自TIANGEN。总菌PCR扩增程序为95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ～64 ℃ 25 s，39个循环;大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌PCR扩增程序均为95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ～64 ℃ 25 s，49 个循环。

表2 各菌PCR引物和探针序列Table 2 Sequences of primers and probe for PCR of bacteria

表3 各菌PCR反应体系Table 3 PCR reaction system of bacteria μL

1.5.5 后肠内容物微生物代谢产物含量

第2周末直肠及第3周末盲肠和直肠内容物的挥发性脂肪酸含量采用气相色谱法测定，氨含量采用比色法测定，挥发性脂肪酸和氨含量测定的具体操作步骤参照陈洪［10］的方法进行;乳酸采用化学比色法测定，具体操作参照南京建成试剂盒说明书进行。

1.6 数据处理

结果以平均值±标准误表示，数据处理与分析采用SAS 8.2统计软件，将对照组和霉变玉米组以及霉变玉米组和采食量配对组分别进行t检验，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 霉菌毒素含量

玉米及饲粮霉菌毒素含量见表4。可见，霉变玉米主要受黄曲霉毒素B1污染，含量超标，进而导致霉变玉米组饲粮黄曲霉毒素B1也超标，而脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮可检出，但含量未超标。

表4 饲料中主要霉菌毒素含量(饲喂基础)Table 4 M ycotoxin contents in diets(as-fed basis) μg/kg

2.2 不同处理对仔猪生长性能的影响

不同处理对仔猪生长性能的影响结果见表5。与对照组相比较，霉变玉米组仔猪的平均日增重和平均日采食量在试验前2周及全期均有降低的趋势，但差异不显著(P＞0.05)。而与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪的全期平均日增重显著增加(P＜0.05)，全期料重比则显著降低(P＜0.05)。

表5 不同处理对仔猪生长性能的影响Table 5 Effects of different treatments on growth performance of piglets

2.3 不同处理对仔猪肠道形态结构的影响

不同处理对仔猪肠道形态的影响结果见表6。与对照组相比，霉变玉米组仔猪空肠绒毛高度与隐窝深度的比值显著降低(P＜0.05);与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪空肠绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度均显著降低(P＜0.05)，隐窝深度显著提高(P＜0.05)。

表6 不同处理对仔猪肠道形态的影响Table 6 Effects of different treatments on the intestinalmorphology of piglets μm

2.4 不同处理对仔猪后肠微生物数量的影响

不同处理对仔猪后肠菌群的影响结果见表7。与对照组相比，霉变玉米组仔猪第3周末直肠内容物乳酸杆菌数以及盲肠内容物大肠杆菌数和乳酸杆菌数均显著提高(P＜0.05);与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪的直肠和盲肠内容物中各菌数均无显著差异(P＞0.05)。

表7 不同处理对仔猪后肠菌群的影响Table 7 Effects of different treatments on intestinal flora of piglets

续表7

2.5 不同处理对仔猪后肠微生物代谢产物的影响

不同处理对仔猪后肠微生物代谢产物的影响结果见表8。与对照组相比，霉变玉米组仔猪第3周末直肠和盲肠内容物中丙酸含量及直肠内容物中丁酸含量均显著提高(P＜0.05);第3周末直肠内容物氨含量及盲肠内容物中乳酸含量均有提高的趋势(P＞0.05)。与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪的第2周末直肠内容物乙酸和总挥发性脂肪酸含量显著降低(P＜0.05)，第3周末盲肠内容物中丙酸含量显著提高(P＜0.05);第3周末直肠和盲肠内容物氨含量均有提高的趋势(P＞0.05)。

表8 不同处理对仔猪后肠微生物代谢产物的影响Table 8 Effects of different treatments on metabolic products of intestinalm icroorganism s in piglets

续表8

3 讨论

3.1 不同处理对仔猪生长性能的影响

本试验所用自然霉变玉米主要以黄曲霉毒素B1(168.66μg/kg)污染为主。黄曲霉毒素会抑制猪的生长发育，导致免疫器官发育受阻，抑制免疫功能，损害生殖功能等。Harvey等［11］研究发现2.5 mg/kg黄曲霉毒素组生长猪体增重显著低于对照组;Schell等［12］研究发现922 μg/kg黄曲霉毒素可极显著降低仔猪平均日采食量和平均日增重;史莹华等［13］报道0.1 mg/kg黄曲霉毒素可导致生长猪平均日增重极显著降低12.90%，料重比极显著提高7.54%。本试验也发现与对照组相比，自然霉变玉米组饲粮导致仔猪平均日增重和平均日采食量的降低，但与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪平均日增重增加，料重比降低。该结果表明，在本试验条件下自然霉变玉米导致仔猪平均日增重的降低主要是降低了平均日采食量。冯光德［5］研究发现在1～7 d、8～14 d和1～14 d，自然霉变玉米组肉鸭平均日增重较采食配对组分别极显著增加了4.63%、18.25%和13.83%;霉变玉米组肉鸭全期料重比较正常玉米组和采食配对组分别极显著降低了4.90%和5.56%。此外，叶涛［14］用含呕吐毒素为主的自然霉变玉米饲喂生长肥育猪，结果发现生长育肥猪的饲料转化效率因霉变玉米的使用而得以改善(即料重比降低)。产生上述结果的可能原因包括2个方面:一方面玉米自然霉变过程中可能产生一些未知成分，如蛋白酶和淀粉酶等消化酶，使得可溶性糖和还原糖含量提高，进而对仔猪产生一定的促生长作用［15］;另一方面，采食量配对组仔猪因采食量的受限可能导致维持需要的增加，从而使采食量配对组仔猪的料重比增加。

3.2 不同处理对仔猪肠道形态结构的影响

小肠是消化道内营养物质吸收和转运的主要部位。小肠绒毛主要负责营养物质的吸收，绒毛高度越高说明成熟细胞越多，吸收功能越强;隐窝深度反映细胞的生成率，隐窝深度越浅，说明细胞成熟率上升，分泌功能增强［16］。绒毛高度与隐窝深度的比值综合反映了小肠的吸收功能，比值越大养分吸收能力越强。苏军［8］研究发现随饲粮中霉变玉米替代比例的增加，仔猪十二指肠和空肠前段的绒毛高度呈显著线性或二次曲线降低，十二指肠前段隐窝呈显著线性加深，空肠前段隐窝呈显著线性或二次曲线加深。本试验研究发现，霉变玉米显著降低空肠绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度比值，显著增加隐窝深度，表明自然霉变玉米能损伤仔猪空肠形态结构，与前人研究结果一致。空肠结构的损伤将抑制养分的吸收，进而影响霉变玉米组仔猪的生长性能。

3.3 不同处理对仔猪肠道菌群和微生物代谢产物的影响

正常动物的肠道微生物区系处于动态平衡中。健康仔猪从十二指肠到结肠，双歧杆菌、乳杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、类杆菌、梭菌和肠球菌8种细菌数量都随肠段后移而逐渐增加［17－18］。在肠道中，挥发性脂肪酸主要来源于梭形杆菌等厌氧菌对碳水化合物和未消化蛋白质的发酵［19］，氨是肠道腐败菌分解未消化的蛋白质而产生的［20］。

动物摄入含黄曲霉毒素B1的食物后，约有50%黄曲霉毒素B1在十二指肠被吸收，未被吸收的黄曲霉毒素B1进入后肠，若肠道黏膜受损，则病原微生物较易定植，且因形态结构的损伤对营养物质的消化和吸收可能受限，致使进入后肠的营养物质增多，造成微生物发酵异常。当肝脏结构功能异常时，肠道微生态环境也将遭到破坏。本试验结果发现自然霉变玉米饲粮提高仔猪第3周末盲肠内容物大肠杆菌数、乳酸杆菌数和丙酸含量以及直肠内容物乳酸杆菌数、丙酸和丁酸含量，氨含量有提高的趋势。可能是由于霉菌毒素造成仔猪肠道受损，进入后肠养分增加，被乳酸杆菌和大肠杆菌利用，促进其数量及代谢产物丙酸的增加。结果表明，本试验条件下，霉变玉米饲粮会改变仔猪后肠菌群结构，而变化的原因及带来的可能影响有待进一步研究。

4 结论

自然霉变玉米(含168.66μg/kg黄曲霉毒素B1)有降低仔猪平均日采食量和平均日增重的趋势，并可损伤空肠形态结构，提高盲肠大肠杆菌数和乳酸杆菌数，改变肠道微生物区系。

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*Corresponding author，associate professor，E-mail:ybingtian@yahoo.com.cn

(编辑 陈 鑫)

Effects of Maize Contam inated with Naturally-Occuring M ycotoxins on Intestinal Microecology in Piglets

LEIXiaoya CHEN Daiwen MAO Xiangbing MAO Qian CHEN Hong ZHANG Ling DUAN Xudong YU Bing*
(Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University，Key Laboratory for Animal Disease-resistance Nutrition of China Ministry of Education，Ya’an625014，China)

This experiment was conducted to study the effects of maize contam inated with naturally-occuring mycotoxins on growth performance，intestinalmorphology，intestinalm icrobial populations and theirmetabolic products in piglets.Fifteen PIC piglets(35 days of age)were random ly allocated to 3 dietary treatments with 5 replicates per treatment and 1 piglet per replicate.Piglets in group 1 were fed a basal diet(normalmaize，control group);piglets in group 2 were fed the dietwith contam inated maize(normalmaize in the group 1 was 100%replaced bymycotoxin-contam inatedmaize，contaminatedmaize group);group 3 was a pair-fed group.For the pair-fed group，the basal dietwas pair-fed to piglets at the level of feed intake of piglets fed the contam inated maize diet.The trial lasted for 21 d.The results showed that contam inated maize trended to decrease the arerage daily gain(ADG)and arerage daily feed intake(ADFI)compared with the control group during the first two weeks(P＞0.05)，whereas during thewhole trial period，ADG in the contam inated maize group was significantly higher and feed/gain ratio(F/G)was significantly lower than those in the pair-fed group(P＜0.05).The ratio of villus height to crypt depth of jejunum in the contam inated maize group was significantly lower than that in the control and pair-fed group(P＜0.05)，and the crypt depth was significantly higher than that in the pair-fed group(P＜0.05).Compared with the pair-fed group，the levels of acetic acid and total volatile fatty acids in rectum contents in the contam inated maize group were decreased significantly on the second weekend(P＜0.05).On the third weekend，the number ofEscherichia coliandLactobacillusand the level of propionic acid in cecum contents in the contam inated maize group were significantly higher than those in the control group(P＜0.05)，and the concentration of ammonia trended to be increased(P＞0.05).In conclusion，maize naturally contam inated with mycotoxins can damage mucosal morphology of jejunum，increase the number ofEscherichia coliandLactobacillusin cecum contents，break the balance of intestinal flora，and then influence the health of piglets.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(10):1790-1799］

maize contam inated with naturally-occuring mycotoxins;piglets;growth performance;intestinal flora;metabolic products

S828

A

1006-267X(2011)10-1790-10

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.10.020

2011－04－13

四川省科技支撑计划“生猪现代产业链关键技术研究与集成示范”(09ZC1292)

雷晓娅(1986—)，女，四川什邡人，硕士研究生，从事猪的营养研究。E-mail:leixiaoya11@163.com

*通讯作者:余 冰，副教授，硕士生导师，E-mail:ybingtian@yahoo.com.cn