β－防御素在金华猪和长白猪肠道中表达规律的研究

安 沙 韩菲菲 高彦华 刘倚帆 汪以真

(浙江大学饲料科学研究所，动物分子营养学教育部重点实验室，浙江省动物饲料与营养重点实验室，杭州 310029)

β－防御素在金华猪和长白猪肠道中表达规律的研究

安 沙 韩菲菲 高彦华 刘倚帆 汪以真*

(浙江大学饲料科学研究所，动物分子营养学教育部重点实验室，浙江省动物饲料与营养重点实验室，杭州 310029)

本试验旨在研究金华猪和长白猪从初生到60日龄不同肠段中3种β－防御素［β－防御素－1(pBD-1)、β－防御素 －2(pBD-2)和 β－防御素 －3(pBD-3)］基因表达规律，并比较β－防御素基因在2个品种之间的表达差异。选取初生、20、40和60日龄的金华猪和长白猪各3头，屠宰后取十二指肠、空肠、回肠和结肠组织，实时定量PCR法检测各肠段pBD-1、pBD-2和pBD-3基因的表达量。结果表明:1)从初生到60日龄，随日龄的增加pBD-1和pBD-3基因在猪肠道中的表达量升高，pBD-2基因在十二指肠和空肠中的表达量升高，而在猪结肠和回肠中的表达量先下降后上升。2)在20、40和60日龄时，金华猪各肠段中3种β－防御素基因的表达量均高于长白猪。3)初生和20日龄，金华猪十二指肠pBD-1基因表达量极显著高于长白猪(P＜0.01);60日龄pBD-1基因在空肠、回肠和结肠中的表达量，金华猪显著高于长白猪(P＜0.05)，pBD-2基因在十二指肠、回肠和结肠的表达量，金华猪显著高于长白猪(P＜0.05)，金华猪pBD-3基因在十二指肠、空肠和回肠的表达量显著高于长白猪(P＜0.05)，结肠中的表达量极显著高于长白猪(P＜0.01)。结果显示，初生到60日龄，pBD-1和pBD-3基因在猪肠道中的表达呈上升趋势，金华猪肠道中3种β－防御素的表达水平在20、40和60日龄均高于长白猪。

β－防御素;金华猪;长白猪;肠道;基因表达

抗菌肽是一类广泛存在于动植物体内的小分子肽，作为哺乳动物先天性免疫的第一道防线，对抵御外来微生物的入侵发挥重要作用［1］。与抗生素相比，抗菌肽除具有广谱的抗细菌、真菌和病毒作用外，还具有分子量小、热稳定性高、水溶性好、不易产生耐药性等优点，因此成为了研究热点［2］。作为哺乳动物体内重要抗菌肽，防御素广泛分布在动物呼吸道、消化道等上皮组织中，是一类富含精氨酸的阳离子多肽，含有6～8个半胱氨酸组成的3～4个二硫键，形成的分子结构稳定。根据防御素二硫键的连接位置及形成的空间结构，可将其分为α－、β－和θ－防御素［3］。其中，在猪体内仅发现了β－防御素，研究较多的是β－防御素－1(pBD-1)、β－防御素 －2(pBD-2)和 β－防御素－3(pBD-3)。此3种防御素广泛分布于猪的呼吸道、消化道、胸腺、脾脏、淋巴结、脑、肝、肾、皮肤、骨髓和脐带中，参与组成机体的先天性免疫系统［4］。目前，对防御素的研究多集中于其抗菌能力及机理方面，对其在猪先天性免疫系统(特别是肠黏膜免疫)中作用的研究较少［5］。研究表明，pBD-1和pBD-3基因为组成型表达，在猪的肠黏膜具有较高表达量［6］;pBD-2基因为诱导型表达，在猪肠道中的表达受肠道微生物的影响，如沙门氏菌可上调体外培养肠上皮细胞系pBD-2基因的表达［7］。

金华猪，又称“金华两头乌”，是我国著名的优良地方品种之一，具有肉品质好、繁殖率高、抗逆性强等优点。原产丹麦的长白猪，因生长速度快、饲料转化率高，而在世界各地广泛分布，但该品种的抗逆性有所下降［8］。研究表明不同猪种的抵御外界病原微生物入侵的能力有别，且其免疫力也有所差异。通过免疫功能比较试验证明，杜洛克和大白猪的免疫力存在差异［9］;同样饲养管理条件下，大白猪和太湖猪的免疫功能也具有明显差异［10］。但是，这种差异出现的机制却鲜有报道。本试验通过实时定量PCR法，检测β－防御素基因在金华猪和长白猪不同肠段中的表达量、表达规律和不同品种间的表达差异，为揭示猪抗菌肽基因表达水平与抗病力和免疫功能之间的关系奠定基础，为阐明抗菌肽在肠道免疫功能中的作用积累试验数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及样品处理

选取相同环境下饲养的初生、20、40和60日龄的金华猪和长白猪各3头，试验期间猪自由采食、饮水，饲养管理按日常管理进行。屠宰前空腹12 h，放血致死，取十二指肠、空肠、回肠和结肠肠段各3 cm，所取各肠段位置相对固定，弃内容物，用预冷的磷酸缓冲液(PBS)冲洗干净，液氮速冻，－80℃保存备用。

1.2 总RNA提取

取50mg样品于液氮预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末，转移到1.5 m L离心管，加1 m L Trizol(Invitrogen公司，美国)，剧烈震荡;冰上静置5 m in，加 0.2 m L 氯仿，剧烈震荡15 s，12 000 ×g、4℃离心15 m in;吸上清液于新的离心管中，加入等体积异丙醇，低温静置30 m in;12 000×g、4℃离心10 m in，弃上清，加1 m L 75%乙醇洗涤;12 000×g、4℃离心 8 m in，弃上清，干燥后加入30μL无酶水溶解。紫外分光光度计检测样品260 nm和280 nm的吸光值，计算提取的总RNA浓度，计算 OD260nm/OD280nm，比值在 1.8 和 2.0 之间的样品可用于下一步试验。

1.3 反转录

反应体系中加入 2μg总 RNA，1μL 10μmol/L随机引物及相应体积的无酶水，65℃孵育5 m in，立即置于冰上;加4μL 5×反转录缓冲液、2 μL 10 mmol dNTP、1 μL M-M uLV 反转录酶(200 U)，终体积为20μL，25℃孵育10 m in后，转入42℃，孵育1 h。

1.4 实时定量PCR

1.4.1 引物设计

以18S rRNA为内参，内参基因和目标基因的引物序列均参考文献［11－13］，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及参数见表1。

表1 实时定量PCR引物序列及参数Table 1 Sequences and parameters of primers for real-time PCR

1.4.2 实时定量PCR反应

利用反转录合成的cDNA对18s rRNA及目的基因进行实时定量PCR。PCR扩增体系如下:1μL模板 cDNA、0.5 μL 上游引物、0.5 μL 下游引物、10.4 μL SYBR Green PCR Mix，加水补足至20μL。PCR反应条件:94℃预变性2 m in;94℃变性10 s，61℃退火延伸30 s，共40个循环。PCR结束后，将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳法检测目的基因条带大小。

用比较模板的域值循环数(Ct)相对定量法研究肠道组织中3种防御素mRNA的表达量。以内参基因18S rRNA为参比，目的基因相对表达量以2－△△Ct表示。

1.5 数据处理

数据采用SPSS 16.0统计软件进行统计整理，结果用平均值±标准差表示，各组织间的基因表达采用One-way ANOVA分析，并用Duncan氏法进行多重比较，2品种间的统计用t检验法进行。

2 结果

2.1 pBD-1基因在猪肠道中的表达规律

由图1可见，猪不同肠段pBD-1基因表达量随日龄变化存在一定规律，不同品种间亦存在差异。从初生到60日龄，pBD-1基因表达量随日龄增加呈现上升趋势。所有日龄金华猪各肠段的表达量均高于长白猪，其中十二指肠在初生和20日龄的表达量极显著高于长白猪(P＜0.01)，40日龄显著高于长白猪(P＜0.05);60日龄，空肠、回肠和结肠中的基因表达量均显著高于长白猪(P＜0.05)。

2.2 pBD-2基因在猪肠道的表达规律

由图2可见，猪肠道pBD-2基因的表达随日龄变化存在一定规律，不同品种间存在差异。初生到60日龄，在十二指肠和空肠的表达量，随猪日龄的增加呈现上升趋势;回肠和结肠的表达量随日龄增加呈现先下降后上升的趋势。所有日龄金华猪肠道pBD-2基因表达量均高于长白猪，其中十二指肠、回肠和结肠中的表达量在60日龄时显著高于长白猪(P＜0.05)。

图1 金华和长白猪不同肠段pBD-1基因相对表达量Fig.1 Relative expression levels of pBD-1 gene in different segments of intestine of Jinhua and Landrace pigs

图2 金华和长白猪不同肠段pBD-2基因相对表达量Fig.2 Relative expression levels of pBD-2 gene in different segments of intestine of Jinhua and Landrace pigs

2.3 pBD-3基因在猪肠道的表达规律

由图3可见，猪肠道pBD-3基因的表达随日龄变化存在一定规律，不同品种间存在差异。初生到60日龄，随日龄增加pBD-3基因在4个肠段表达量呈现上升趋势。在20、40和60日龄，金华猪所有肠段pBD-3基因的表达量均高于长白猪，其中60日龄，金华猪十二指肠、空肠和回肠的表达量均显著高于长白猪(P＜0.05)，结肠中的表达量极显著地高于长白猪(P＜0.01)。

3 讨论

作为哺乳动物先天性免疫系统的重要组成部分，抗菌肽在机体的免疫中发挥着重要作用。抗菌肽与抗生素相比，抗菌谱广、抗菌机理独特，因而成为近年来研究的热点［14］。对于抗菌肽的研究多集中在体外抗菌、作用机制等方面，而对其基因在体内表达变化的研究较少。本试验以地方(金华猪)和引进品种猪(长白猪)为研究对象，比较了不同日龄、品种、肠段的β－防御素基因表达量，初步揭示了抗病力不同的2个品种猪体内防御素的表达特点。

本试验结果表明，从初生到60日龄，2品种仔猪肠道中pBD-1和pBD-3基因表达量随日龄的增加而上升，pBD-2基因的表达趋势较为复杂。防御素是宿主执行免疫防御能力的细胞所分泌的、具有杀微生物活性和细胞毒性的小分子多肽。β－防御素在动物呼吸道、消化道，以及胸腺、脑、心脏等各组织器官中广泛分布［15］。一般认为，防御素基因的表达方式有2种:组成型和诱导型。其中 pBD-1和 pBD-3基因为组成型表达［16］，pBD-1基因的表达具有组织特异性，在舌组织的表达量高于在其他组织器官［17］。作为诱导型的防御素，PBD-2基因的表达受多种因素影响［18］，如鼠伤寒DT104沙门氏菌，它能够上调IPI-2细胞系pBD-2基因的表达［12］。研究表明初生、7、28 和49日龄仔猪，舌组织中pBD-1基因表达量随日龄增加而上升［17］;从初生到28日龄，随着日龄增加骨髓抗菌肽(protegrin-1)基因的表达量显著增加，28日龄断奶应激引起了抗菌肽表达量有所下降，但断奶后2周抗菌肽表达又呈增加趋势［19］。本试验结果揭示了金华猪和长白猪β－防御素基因在4个肠段均有表达，且pBD-1和pBD-3基因的表达随日龄呈现上升趋势，与上述研究结果类似。该变化趋势与2种β－防御素的组成型表达有关，β－防御素由仔猪肠道上皮细胞合成分泌，形成抵御微生物的分子屏障［20］，随猪日龄的增加，其肠道黏膜免疫功能逐渐完善，防御素在仔猪肠道免疫中发挥的作用也日趋显现，因而防御素的表达随日龄增加而呈现上升趋势。诱导型防御素pBD-2在十二指肠和空肠的表达随日龄的增加而呈上升趋势，而在回肠和结肠的表达随日龄的增加呈现先下降后上升的趋势。可能由于pBD-2基因的表达与回肠和结肠中多种微生物的形成有关，因而在这个2个肠段中的表达呈现更为复杂。

图3 金华长白猪不同肠段pBD-3基因相对表达量Fig.3 Relative expression levels of pBD-3 gene in different segments of intestine of Jinhua and Landrace pigs

通过比较初生、20、40和60日龄的金华猪和长白猪肠道β－防御素基因的表达量，可以看出金华猪肠道内3种β－防御素基因的表达量均高于长白猪。在梅山猪的多数组织中3种β－防御素基因的表达均高于长白猪［21］，与本试验结果类似;藏猪pBD-1和pBD-3基因在多数组织中的表达量高于杜 长 大杂交猪［13］。这是不同品种的猪的抗病力不同的因素之一。

本试验对2个猪种的肠道防御素表达的研究表明，pBD-1基因在初生、20和40日龄金华猪的十二指肠中表达量极显著的高于长白猪，这可能与在仔猪生长的前期阶段，组成表达型的pBD-1在猪十二指肠中的免疫起着重要作用有关。随日龄的增加，pBD-2和pBD-3基因的表达量在60日龄金华猪和长白猪各肠段的表达有显著差异，可能是由于随仔猪的生长，这2种防御素在免疫和抗病方面起的作用逐渐凸显。仔猪自身的生长发育各阶段，起主要作用的防御素不同可能是造成地方优良品种金华猪和国外引进品种长白猪抗病力不同的另一方面因素。上述研究结果说明免疫力不同猪肠道内防御素的表达存在差异，且地方品种肠道防御素的表达量高于引进品种。本试验初步揭示了免疫力不同的猪肠道内防御素的表达有差异，为进一步研究抗菌肽表达与免疫力、抗病力之间的关系奠定基础。

4 结论

①初生到60日龄，仔猪肠道pBD-1和pBD-3基因的表达量在2种猪各肠段均随日龄的增加呈上升趋势，pBD-2在猪回肠和结肠的表达量随日龄的增加呈现先下降后上升的趋势。

②金华猪肠道中3种防御素的表达量在20、40和60日龄均高于长白猪。

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*Corresponding author，professor，E-mail:yzwang@zju.edu.cn

(编辑 王智航)

Gene Expression Profile ofβ-Defensins in Intestinal Tract ofJinhuaand Landrace Pigs

AN Sha HAN Feifei GAO Yanhua LIU Yifan WANG Yizhen*
(Key Laboratory for Molecular Animal Nutrition of Ministry of Education，Key Laboratory for Feed and Animal Nutrition of Zhejiang Province，Institute of Feed Science，Zhejiang University，Hangzhou310029，China)

The study was conducted to investigate gene expression regularity of the three kinds ofβ-defensins［β-defensins-1(pBD-1)，β-defensins-2(pBD-2)andβ-defensins(pBD-3)］in different segments of intestinal tract inJinhuaand Landrace pigs from new-born to 60 days of age，and to compare differences ofβ-defensins gene expression between the two breeds.Three heads ofJinhuapigs and Landrace pigs(new-born，20，40 and 60 days of age)were selected and slaughtered，respectively，and tissue samples of duodenum，jejunum，ileum and colon were collected for analysis of gene expression levels of pBD-1，pBD-2，pBD-3 by real-time PCR.The results showed as follows:1)with the days of age increasing，pBD-1 and pBD-3 gene expression levels in intestine increased，and pBD-2 gene expression level in duodenum and jejunum increased，while that in ileum and colon tended tofirstly decrease and then increase.2)A t20，40 and 60 days of age，gene expression levels of the threeβ-defensins in different segments of intestine inJinhuapigswere higher than those in Landrace pigs，respectively.3)gene expression level of pBD-1 in duodenum ofJinhuapigswas significantly higher than thatof new-born and 20-day-age Landrace pigs(P＜0.01);at60 days of age，gene expression level of pBD-1 in jejunum，ileum and colon ofJinhuapigswas significantly higher than that of Landrace pigs(P＜0.05)，gene expression level of pBD-2 in duodenum，ileum and colon ofJinhuapigswas significantly higher than that of Landrace pigs(P＜0.05)，and gene expression level of pBD-3 in duodenum(P＜0.05)，jejunum(P＜0.05)，ileum and colin(P＜0.01)ofJinhuapigs was significantly higher than that of Landrace pigs(P＜0.05).These results indicate that the gene expression levels of pBD-1and pBD-3 increase in the intestinal tractof pigs from birth to 60 days of age，and gene expression levels of the threeβ-defensins inJinhuapigs are higher than those in Landrace pigs at20，40 and 60 days of age.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(10):1762-1768］

β-defensins;Jinhuapigs;Landrace pigs;intestinal tract;gene expression

S828

A

1006-267X(2011)10-1762-07

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.10.016

2011－05－06

高等学校全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目(2007B6)资助

安 沙(1987—)，女，山东枣庄人，硕士研究生，从事动物营养与免疫的研究。E-mail:ansha168@163.com

*通讯作者:汪以真，教授，博士生导师，E-mail:yzwang@zju.edu.cn

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