酮病奶牛肝脏脂肪酸代谢研究进展

李鹏 张才龙淼 刘国文 王哲

酮病是高产奶牛在泌乳初期由于能量负平衡所引发的一种以肝脏脂肪酸氧化代谢紊乱和酮体升高为主要病理特征的围产期能量代谢障碍性疾病。由于妊娠后期奶牛采食量下降，干物质摄入减少，而泌乳初期机体对能量的需求增加，机体处于能量负平衡营养应激状态，使得这一时期成为酮病的高发期。能量负平衡必然引发脂肪动员，从而释放大量非酯化脂肪酸（NEFA）进入血液，并最终进入肝脏代谢。但目前国内外有关酮病奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢状态的报道不多，对其主要代谢特点、影响因素和关键环节尚不清楚。本文主要对目前有关酮病奶牛肝脏脂肪酸摄入、脂肪酸的代谢过程及其代谢结局分别进行阐述。

1 肝脏中脂肪酸的来源

与非反刍动物不同，反刍动物肝脏缺乏脂蛋白脂酶，自身分解甘油三酯而获得脂肪酸的能力有限。因此，肝脏脂肪酸主要来源于脂肪动员所产生的游离脂肪酸（NEFA）。当机体处于能量负平衡状态时，脂肪组织大量动员。脂肪分解一方面促进肝脏糖异生作用，以缓解能量亏欠；另一方面必然造成大量的NEFA经血液循环进入肝脏。肝脏摄入NEFA的量与其在血液中的浓度及肝脏的血流速度有关。有研究表明，血液中7%～25%的NEFA可被肝脏吸收[1]。而肝脏血流速度与奶牛摄入的代谢能成正比，有研究表明，泌乳期奶牛较干奶期奶牛肝脏血流速度高52%，而能量负平衡时血中NEFA浓度增加[2]。因此，血流速率和血中NEFA浓度对于肝脏脂肪酸摄入的影响是相反的，肝脏摄入NEFA的量随着血液中NEFA的浓度的增加而增加，但血流速度加快可以减少肝脏NEFA的摄入。虽然肝脏血流速度和血液中NEFA浓度均对肝脏脂肪酸的摄入有影响，但NEFA浓度变化的影响要大于血流速度对肝脏脂肪酸摄入的影响。另外，脂肪酸与血清白蛋白的亲和力也是决定其摄入的关键因素[21]。

2 脂肪酸氧化代谢

脂肪酸在肝脏的去路主要有两个：①由β-氧化途径生成乙酰辅酶A经柠檬酸循环氧化代谢，同时部分氧化生成酮体；②再酯化形成甘油三酯后在肝脏储存或以脂蛋白形式分泌出肝外。机体完成脂肪酸β-氧化代谢的器官主要有线粒体和过氧化物酶体两种，二者对于脂肪酸的氧化代谢分别有着各自不同的特点。

2.1 脂肪酸在线粒体内的氧化及影响因素

线粒体主要完成≤20个碳原子的脂肪酸代谢。脂肪酸氧化过程主要包括4个步骤：①摄入和活化脂肪酸生成脂酰辅酶A；②脂酰辅酶A转运进入线粒体；③脂酰辅酶A的β-氧化；④酮体生成。肉碱脂酰转移酶系统可以转运脂肪酸进入线粒体，主要包括3种酶类：CPT-I，肉碱棕榈酰转移酶-I；肉碱脂酰肉碱移位酶；CPT-Ⅱ，肉碱棕榈酰转移酶-Ⅱ。CPT-I位于线粒体外膜，催化脂酰辅酶A和肉碱合成脂酰肉碱并进一步将其转运进入线粒体，是脂肪酸代谢的关键调控步骤。目前国内外对于肝脏脂肪酸代谢的研究多集中在对CPT-I基因表达的调控上。

脂肪酸在线粒体内的氧化代谢主要受CPT-I活性、丙二酰辅酶A浓度和CPT-I对丙二酰辅酶A抑制作用的敏感性的变化三方面影响。虽然CPT-I对于反刍动物肝脏摄入NEFA的量起着关键性的作用，但我们对其表达和调控作用所知甚少，特别是在围产期的奶牛。Aiello[3]报道，对从牛和羊肝脏中分离的线粒体的研究表明，其CPT-I的活性可以被丙二酰辅酶A和甲基丙二酸辅酶A所抑制。对小鼠的研究表明，CPT-I表达除了受丙二酰辅酶A浓度变化的影响，CPT-I对丙二酰辅酶A抑制的敏感性也受生理状态的调控。在血液胰岛素浓度过低或胰岛素抵抗状态，CPT-I对丙二酰辅酶A的抑制作用敏感性低[4]。小鼠的这些变化的结果导致CPT-I表达增加，细胞内丙二酰辅酶A浓度下降，CPT-I对丙二酰辅酶A的抑制作用的敏感性降低，从而导致酮体生成。但对于奶牛丙二酰辅酶A对CPT-I的抑制浓度尚不清楚。

脂肪酸氧化代谢途径还受到其它代谢产物和激素的影响。Cadórniga-Valio[5]证实，高浓度BHBA可导致脂肪酸β-氧化和肝脏细胞三羧酸循环作用降低；而高浓度NEFA促进肝细胞内脂肪形成和酮体生成，损坏肝脏脂肪酸代谢功能。Louet[6]的研究表明，长链脂肪酸可以提高CPT-I mRNA的表达，促进脂肪酸氧化代谢，而胰高血糖素和甲状腺素（T3）具有同样相似的作用，但胰岛素的作用则正好相反。而Casta~neda-Guti'errez[20]报道，围产期奶牛日粮补充饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸并未对产后CPT-I和PPARα mRNA的表达产生显著影响，并认为围产期补充脂肪酸并不会对泌乳早期奶牛肝脏脂肪酸代谢产生实质性影响。

2.2 脂肪酸在过氧化物酶体内的氧化

肝脏NEFA氧化的另一个途径是过氧化物酶体，而过氧化物酶体是存在于机体大多数器官的一个亚细胞器。过氧化物酶体中的氧化途径与线粒体中的相似，主要的区别是：①氧化的开始步骤受乙酰辅酶A氧化酶催化，生成过氧化氢而不是NAD。相对于线粒体而言，过氧化物酶体中的β-氧化过程消耗较少的能量并释放更多的热量。②过氧化物酶体中不包括能生成ATP的呼吸链。因此，过氧化物酶体中的β-氧化作用不受细胞能量需求的控制[7]。这种特性使过氧化物酶体的β-氧化作用更适合脂肪酸的部分氧化以及线粒体酶不能氧化的一些外源性复合物。

在牛肝组织培养物和分离的羊肝细胞中添加四癸基环氧丙酸（一种CPT-I抑制剂）时，大量NEFA β-氧化作用仍可发生，表明反刍动物肝脏过氧化物酶体中存在β-氧化作用[8]。随后的研究表明，在牛肝脏组织匀浆中过氧化物酶体β-氧化作用有充分的活性。对于牛，过氧化物酶体可以氧化总软脂酸盐的50%，但在小鼠只有26%，表明过氧化物酶体的β-氧化作用对于反刍动物尤为重要。干奶期饲喂高脂肪日粮，过氧化物酶体的β-氧化作用增强，表明这个途径在奶牛是可以通过诱导而引发的，且可能对于围产期是十分重要的[9]。但目前关于脂肪酸在过氧化物酶体中氧化代谢的影响因素、调控机制及其与酮病发生之间的关系尚待于进一步研究。

2.3 酮体生成

在非反刍动物，肝脏利用NEFA合成的酮体被用来作为一种能量储备，在葡萄糖不足的情况下为机体提供能量。尽管奶牛对于葡萄糖的氧化利用普遍低于非反刍动物，但当围产期葡萄糖氧化大量减少时奶牛也可以发生相似的过程。酮体可以被反刍动物的心脏、肾脏、骨骼肌、乳腺以及胃肠道等组织氧化利用，并可以合成乳脂[12]。因此，围产期酮体生成增加可能对葡萄糖前体摄入的不足是一种补偿。其实反刍动物组织对酮体的利用能力是非常有限的，并最终导致酮体在机体内大量蓄积，从而引发酮病。

肝脏酮体生成过程主要受以下几个方面的调控：①肝脏摄入NEFA的量；②CPT-I的活性；③3-羟基-3-甲戊二酰-辅酶A合酶（HMGCoA合酶）[10]的活性。HMGCoA合酶是肝脏酮体生成的关键限速酶，其活性可以受到琥珀酰辅酶A的抑制。因此，对于围产期奶牛，日粮补充丙酸盐可以增加线粒体内琥珀酰辅酶A的浓度，从而使HMGCoA合酶的活性受到抑制。反之亦然，丙酸盐的摄入减少可以降低线粒体内琥珀酰辅酶A的浓度，从而有利于酮体的生成[11]。而目前关于围产期奶牛HMGCoA合酶表达和活性的变化尚不清楚。

对于奶牛酮病的发病机理，目前普遍认为是由于围产期能量负平衡导致肝脏糖异生增强，从而使大量草酰乙酸离开三羧循环而参加葡萄糖合成。线粒体内草酰乙酸含量减少，NEFA氧化所产生的大量乙酰辅酶A不能与草酰乙酸结合而进入三羧酸循环，最终过量的乙酰辅酶A就会大量生成酮体。随着对线粒体内β-氧化和酮体生成作用的认识不断加深，这种理论受到了一定的质疑。主要是由于几点原因：①在反刍动物NEFA的氧化速率主要受CPT-Ⅰ的调控。②在线粒体内，草酰乙酸通常都是维持一个较低的浓度，这主要是由于NEFA氧化过程中的高NADH/NAD比率。③NEFA β-氧化的产物乙酰辅酶A是丙酮酸羧化酶（PC）的激活剂，其可以维持线粒体内草酰乙酸浓度保持恒定。④不是由于柠檬酸合成所需的草酰乙酸不足，而是由于NEFA氧化过程中的高NADH/NAD比率抑制了柠檬酸循环中脱氢酶的活性。⑤线粒体内琥珀酰辅酶A浓度过低可以活化HMGCoA合成酶而使酮体生成增加。

2.4 甘油三酯合成

反刍动物肝脏用于甘油三酯合成的脂肪酸主要来自于血液循环中的NEFA。因此，肝脏甘油三酯（TG）合成量与血液循环中因脂肪动员产生的NEFA的浓度有关。由于反刍动物肝脏脂肪酸氧化代谢和以极低密度脂蛋白（VLDL）的形式向肝外分泌甘油三酯的能力是有限的，因此，当奶牛处于能量负平衡状态时，脂肪组织动员，产生的大量游离脂肪酸超过了肝脏输出或线粒体β-氧化的能力，那么脂肪酸就会以甘油三酯的形式在肝脏中蓄积而引发脂肪肝。

另外，脂肪酸的酯化速率也是影响甘油三酯合成的主要因素，但对于进入肝脏的脂肪酸是趋向于发生酯化反应还是氧化反应及其关键调控因子目前尚不清楚。Louet[6]指出，当细胞外NEFA浓度增加，NEFA在肝细胞内发生酯化反应的比例增加。高血糖素和E3并未对肝细胞内NEFA发生酯化反应的比例产生影响，但胰岛素可以增加NEFA发生酯化反应的比例。Grum[13]研究表明，对照组和在干奶期饲喂高谷物日粮的奶牛产后1 d的肝脏脂肪酸酯化速率是产前21 d的188%，产后21 d的酯化速率是产前的124%。相反，干奶期饲喂高脂日粮的奶牛产后1 d其酯化反应速率仅增加7%。酯化能力的变化与产后1 d肝脏中甘油三酯含量正相关（r=0.44）。这些变化可能是由肝脏脂肪酸发生酯化反应过程中所涉及的关键酶类的表达和活性的改变所决定的。Van报道，与产前相比奶牛产后肝脏中磷脂酸磷酸酶和二酰基甘油酰基转移酶活性增强，但甘油磷酸酰基转移酶活性并没有变化。而脂肪肝奶牛与健康奶牛相比肝脏中磷脂酸磷酸酶和二酰基甘油酰基转移酶活性并没有差异，但甘油磷酸酰基转移酶活性下降[14-15]。

3 脂肪酸氧化代谢与奶牛酮病

肝脏脂肪酸氧化代谢速率直接影响酮体和TG的生成，是控制奶牛酮病等能量代谢障碍性疾病发生的重要代谢途径。而目前关于酮病奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢状态的报道较少，对其代谢特点及其调控因素尚不清楚。

Vernon[16]报道指出，奶牛产后酮病的发生与肝脏脂肪酸氧化代谢过程相关酶活性变化之间无相关性。Dann[17]研究表明，围产期奶牛肉毒碱棕榈酰基转移酶-I（CPT-I）活性与肝脏总脂、甘油三酯含量、甘油三酯/肝糖原比率和血清非酯化脂肪酸浓度之间正相关。但原发性酮病时，CPT-I活性和敏感性并没有发生显著变化，认为CPT-I基因表达和活性变化并不是导致原发性酮病的主要原因。然而，Murondoti[18]指出，高产奶牛产后肝脏乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶和3-羟酰基-辅酶A脱氢酶活性显著降低，导致脂肪酸氧化代谢能力减弱，从而促使脂肪酸β-氧化代谢产物乙酰辅酶A大量生成酮体。认为产后奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢能力减弱，可能是引发奶牛酮病的主要原因。Chuang Xu[19]利用比较蛋白质组学技术研究了酮病奶牛肝脏的差异蛋白质表达图谱，发现参与脂肪酸β-氧化代谢的3-羟酰基-辅酶A脱氢酶和参与酮体生成的乙酰辅酶A转乙酰酶在酮病奶牛肝脏中二者表达量均显著下降，据此初步推测，奶牛酮病可能存在肝脏脂肪酸氧化代谢能力降低。但就奶牛酮病与肝脏脂肪酸氧化代谢之间的关系尚有待于进一步研究。

4 结语

明确酮病奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢状态，对揭示奶牛酮病的发生机制和制定有效的防治措施尤为重要。随着分子生物学理论和技术的不断发展，针对酮病发生机制的研究应致力于运用先进的分子生物学、细胞生物学和生物化学等技术，从脂肪酸氧化代谢途径相关酶类的基因转录、翻译和重要的中间代谢产物水平综合评价酮病奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢特征及其主要制约因素和关键环节，为揭示奶牛酮病的发生机理奠定理论基础。

[1] Bell A W.Lipid metabolism in the liver and selected tissues and in the whole body of ruminant animals.Prog.Lipid Res.1980,18:117-164.

[2] Lomax M A,Baird G D.Blood flow and nutrient exchange across the liver and gut of the dairy cow.Br.J.Nutr.,1993,49:481-496.

[3] Aiello R J,T.M.Kenna,and J.H.Herbein.Hepatic gluconeogenesis and ketogenic interrelationships in the lactating cow[J].J.Dairy Sci.,1984,67:1707-1715.

[4] Zammit V A.Role of insulin in hepatic fatty acid partitioning:emerging concepts.Biochem[J].J.1996,314:1-14.

[5] Cadórniga-Vali?o,C,Grummer,R.R.,Armentano,L.E.,Donkin.S.S.,Bertics,S.J.Effects of fatty acids and hormones on fatty acid metabolism and gluconeogenesis in bovine hepatocytes.Journal of Dairy Sci.,1997,80:646-56.

[6] J.F.Louet.Regulation of liver carnitine palmitoyltransferase I gene expression by hormones and fatty acids,Biochemical Society Transactions,2001,29:310-316.

[7] James K.Drackley.Biology of Dairy Cows During the Transition Period:the Final Frontier?J Dairy Sci,1999,82:2259-2273

[8] James K.Drackley,D.C.Beitz,J.W.Young.Regulation of in vitro metabolism of palmitate by carnitine and propionate in liver from dairy cows[J].J.Dairy Sci.,1991,74:3014-3024.

[9] Grum D E,J.K.Drackley,R.S.Younker,et al.Nutrition during the dry period and hepatic lipid metabolism of periparturient dairy cows[J].J.Dairy Sci.,1996,79:1850-1864.

[10] James K.Drackley,Adaptations of glucose and long-chain fatty acid metabolism in liver of dairy cows during the periparturient period,J.Dairy Sci.,2001,84:100-112.

[11] Hegart F G.Mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase:a control enzyme in ketogenesis.Biochem.J.1999,338:569-582.

[12] Heitmann R N,D.J.Dawes,and S.C.Sensenig.Hepatic ketogenesis and peripheral ketone body utilization in the ruminant.J.Nutr.1987,117:1174-1180.

[13] Grum D E,J.K.Drackley,R.S.Younker,et al.Nutrition during the dry period and hepatic lipid metabolism of periparturient dairy cows.J.Dairy Sci.,1996,79:1850-1864.

[14] Van Den Top,A.M.,M.J.H.Geelen,et al.Higherpostpartum hepatic triacylglycerolconcentrations in dairy cows with free rather than restricted access to feed during the dry period are associated with lower activities of hepatic glycerolphosphate acyltransferase.J.Nutr.1996,126:76-85.

[15] Van Den Top,A.M.,T.Wensing,M.J.H.Geelen,et al.Time trends of plasma lipids and enzymes synthesizing hepatic triacylglycerol during postpartum development of fatty liver in dairy cows.J.Dairy Sci.,1995,78:2208-2220.

[16] Vernon.A.,Barnes.EEG,hypometabolism,and ketosis during transcendental meditation indicate it does not increase epilepsy risk.Medical Hypotheses,2005,65(1):202-203.

[17] Dann H M,Drackley J K.Carnitine palmitoyltransferase I in liver of periparturient dairy cows:effects of prepartum intake,postpartum induction of ketosis,and periparturient disorders.Journal of Dairy Science,2005,88:3851-3859.

[18] Murondoti A,Jorritsma R,Beynen A C,et al.Unrestricted feed intake during the dry period impairs the postpartum oxidation and synthesis of fatty acids in the liver of dairy cows.Journal of Dairy Science,2004,87:672-679.

[19] Chuang Xu,Zhe Wang.Comparative proteomic analysis of livers from ketotic cows.Veterinary Research Communication,2008,32:263-273.

[20] E.Casta~neda-Guti'errez,S.H.Pelton,R.O.Gilbert,W.R.Butler,Effect of peripartum dietary energy supplementation of dairy cows on metabolites,liver function and reproductive variables,Animal Reproduction Science,2009,112:301-315.

[21] Demant E J F,G.V.Richier,A.M.Kleinfeld.Stoppedflow kinetic analysis of long-chain fatty acid dissociation from bovine serum albumin.Biochem.J,2002,363:809-815.