人脐带间充质干细胞对大鼠坐骨神经损伤的修复效果观察

李德华,单 伟

(辽宁医学院解剖学教研室,辽宁锦州 120001)

周围神经损伤后的再生与修复一直是一大难题。长段周围神经缺损需神经移植术来修复,但自体神经来源受限,异体神经移植后存在免疫排斥反应。近年来,组织工程化神经已成为研究的热点。较为理想的组织工程化神经是由干细胞与生物材料构建而成。人脐带间充质干细胞(HUMSC)具有多向分化的潜能,可表达与其他来源的间充质干细胞(MSC)大致相同的基因[1,2]。另外,HUMSC表达HLA-1,不表达HLA-DR、共刺激分子CD80(B7-1)、CD86(B7-2)和CD40,且表面尚未形成ABO和HLA抗原,缺少 T细胞活化所必需的第二信号系统[3,4],不会引起移植物抗宿主反应。因此,可认为HUMSC是一种较为理想的种子细胞。2010年 8～10月,我们观察了人脐带间充质干细胞(HUMSC)移植对大鼠坐骨神经损伤的修复效果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物、羊膜、细胞及主要试剂 成年健康SD大鼠 80只,体质量 180～230 g,雌雄不限。人羊膜(取自健康、足月、顺产的新鲜胎儿胎盘)。纯化HUMSC。DF12培养基(Invitrogen),胰蛋白酶。

1.2 实验方法

1.2.1 人羊膜的处理、制备 无菌条件下钝性分离胎膜内面的羊膜,氨水消化法处理后平铺于黑色塑料托盘上,切割成2.0 cm×2.5 cm小块,置500 m l无菌PBS中,-20℃冷藏,使用前室温融化。

1.2.2 HUMSC培养 纯化的HUMSC培养后, PBS清洗,0.25%胰蛋白酶消化,1 000 r/m in离心5 min,去上清,加新的培养液,计数细胞,分装培养,传至第 3～4代,用培养基配制 1×106/m l细胞悬液,供羊膜腔注入。

1.2.3 动物模型的制备及观察 80只SD大鼠以10%水合氯醛腹膜腔注射麻醉后,于其股后部做斜行25mm切口,沿股二头肌与股外侧肌之间的间隙钝性分离,寻找、暴露、游离坐骨神经。于梨状肌下缘5 mm处,将已备好的羊膜搭在坐骨神经上,10-0无损伤血管缝线于两端神经外膜上各缝合 1针,切除坐骨神经6～8mm,使其自然回缩形成10mm间隙,羊膜包绕神经断端形成羊膜管,即坐骨神经缺损套管模型,分为实验组和对照组,各 40只。实验组从近端羊膜管进针注入HUMSC细胞悬液,滴适量庆大霉素注射液至切口内,逐层缝合,切口缝以无菌纱布。对照组羊膜腔内注射生理盐水。动物苏醒后正常喂养。于 4、8、12、16、20周,每组随机取 8只大鼠,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,取术侧及对侧腓肠肌的肌腹中段5 mm,4%多聚甲醛固定4 h,梯度酒精脱水,香柏油过夜透明,浸蜡,石蜡包埋,5μm厚横行切片;每隔 5张取1张,每个标本取5张,行HE染色,观察肌细胞的结构;随机测量 10个肌细胞最大长径及与长径垂直的宽径,取均值作为肌细胞的横径。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料比较用多因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验组术后 4周术侧腓肠肌肌细胞结构不均一,8周时肌细胞结构不均一程度减轻,12、16、20周时肌细胞结构逐渐规整;而对照组在 4、8、12、16、 20周时,术侧腓肠肌萎缩程度逐渐加重,肌细胞结构不均一逐渐加重。术后 4、8、12、16、20周时,实验组术侧腓肠肌肌细胞直径分别为(13.21±0.63)、(12.21±0.43)、(14.18±0.60)、(19.07±1.44)、(24.39±1.18)μm,对照组术侧分别为(12.77 ±0.62)、(10.75±0.57)、(5.85±0.47)、(4.45 ±0.77)、(4.36±0.65)μm;与两组手术对侧腓肠肌肌细胞直径的(31.466±0.726)μm相比,P均＜0.01;两组同时间点相比,P均＜0.01;实验组不同时间点相比,P均＜0.05。

3 讨论

人羊膜具有引导神经再生的功能。经过处理的人羊膜细胞外基质由LN、FN、Ⅳ型胶原及硫酸乙酞肝素、蛋白多糖、其他一些蛋白多糖大分子物质构成,与周围神经雪旺细胞基底膜成分类似,但不含细胞成分,因此抗原性极低,其产生的多种生物活性成分又为周围神经再生轴索生长提供了接触引导的物质基础,对神经的再生和HUMSC转化成神经样细胞有明显的促进作用。

HUMSC具有向神经细胞分化的潜能。孙洪涛等[5]采用原代细胞贴壁培养法分离培养HUMSC,在适当诱导条件下可实现向神经细胞方向分化。Mitchell等[6]研究发现,脐带WJ中的纤维样细胞可诱导生成神经样细胞,并表达神经特异质酶(NSE)以及其他神经细胞表面标志物。杨立业等[7]培养HUMSC,发现其可以表达神经细胞标志物,在体外能够分化为形态复杂的神经元样细胞。

周围神经损伤后局部血运丰富,一方面能促进氧的代谢,产生足够的ATP,有利于胞体蛋白质的合成,使新生的胞质不断地流动到损伤轴突近端的末梢;另一方面,可使神经轴突华勒氏变性产物较快消除,有利于神经轴突的再生。这也为HUMSC提供了良好的生存环境,同时也促进HUMSC向神经样细胞分化,达到修复神经的作用。本研究结果显示,实验组术侧置入HUMSC后,腓肠肌肌细胞直径逐渐增大,而对照组则逐渐缩小。提示HUMSC在体内环境下分化神经样细胞且具有神经营养作用,有良好的引导神经再生的作用。其作用机制可能有以下几方面：①HUMSC促进了神经细胞的合成代谢,加速神经损伤修复所需要的蛋白质和能量的合成。②HUMSC减轻了神经损伤节段的缺血、水肿和炎症,缓解局部损伤反应。③HUMSC改善神经损伤处的微环境,促进雪旺细胞的再生和功能,增进损伤神经近端再生轴突和其生长锥的延长。

[1]Rizzieri DA,Bass AJ,Rosner GL,et al.Phase Ievaluation of prolonged-infusion gemcitabinewith mitoxantrone for relapsed or refractory acute leukemia.[J].JClin Oncol,2002,20(3)：674-679.

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[3]Kestendjieva S,Kyurkchiev D,Tsvetkovac T,et al.Characterization of mesenchymal stem cells isolateed from the human umbilical cord[J].Cell Biol Int,2008,32(7)：724-732.

[4]吕璐璐,宋永平,魏旭东,等.人脐带和骨髓源间充质干细胞生物学特征的对比研究[J].中国实验血液学杂志,2008,16(1)：140-146.

[5]孙洪涛,刘晓智,张赛.脐带间充质干细胞分离、鉴定与神经分化[J].中华神经外科疾病研究杂志,2008,7(2)：132-135.

[6]Mitchell KE,Weiss ML,Mitchell BM,et al.Matrix cell from Wharton′s jelly form neurons and glia[J].Stem Cells,2003,21 (1)：50-60.

[7]杨立业,郑佳坤,汪朝阳,等.人脐带来源的基质细胞分化为神经细胞[J].四川大学学报(医学版),2005,36(1)：13-16.