宫颈鳞癌细胞蛋白质组的分析

邱晓菲,张师前,马晓晋

(1滕州市中心人民医院,山东滕州 277500;2山东大学齐鲁医院)

在宫颈癌发生发展过程中存在多个基因的表达异常,实现基因功能表达的最终物质是蛋白质。因此,直接测定蛋白质的水平和活性是了解细胞活动的最好办法。“差异”蛋白质组学是肿瘤标志物筛选的一个突破口[1]。近年来,以激光捕获显微切割(LCM)技术、双向凝胶电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)为基础的蛋白质组学技术已广泛应用于肿瘤的研究。LCM与现代质谱相结合已成为肿瘤标志物筛选的理想技术[2]。2010年9月,我们采用LCM和MALDI-TOF-MS对高同质性宫颈鳞癌组织细胞及正常宫颈细胞进行蛋白质组学的比较研究,以期获取宫颈鳞癌的分子标志物。

1 材料与方法

1.1 宫颈鳞癌组织及正常宫颈组织的获取 人宫颈鳞癌组织及癌旁正常宫颈组织取自山东省立医院和滕州市中心人民医院的宫颈癌手术切除标本,其中宫颈鳞癌 5例份、癌旁正常宫颈组织 4例份。宫颈癌患者未接受放疗或化疗。获取组织 4℃冰盐水冲洗3～5次,均匀分割成0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm组织块,分装于 0.5 m l离心管中,先置液氮中速冻,置-80℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 组织切片的制备及染色 取备检组织,OTC包埋,-25℃切片,厚 8μm。每例标本第1张切片行HE染色,以后每张切片85%、95%(体积分数)乙醇脱水各30 s,无水乙醇2min固定2次。将制备好的组织切片置显微镜载物台,直视下观察选定要切割的区域,按最大捕获效率设定参数。

1.2.2 细胞捕获 采用LCM技术。将切片置于PALM显微激光切割系统 10×10倍目镜直视观察,选定要切割的区域。按照如下条件进行激光捕获：激光能量60%,激光脉冲80 steps/sec。每个样品捕获 50 000～60 000个细胞。

1.2.3 细胞总蛋白提取 将LCM捕获的单一类型宫颈癌细胞群及癌旁正常宫颈细胞分别使用组织裂解缓冲液提取总蛋白,-80℃保存备用。

1.2.4 蛋白双向凝胶电泳 取上述蛋白质样品100μg加入重泡胀液至终体积 350μl。将样本均匀加入持胶槽中,胶面向下放入17 cm IPG干胶条,滴加矿物油,置等电聚焦仪,重泡胀过夜。等电聚焦后,IPG胶条分别在平衡液A(含20 g/LDTT)和B(含25 g/L碘乙酰胺)中各平衡15min。将平衡后的IPG胶条置12%的均匀SDS聚丙烯酰胺凝胶上方,胶条端滴加宽范围的蛋白标记物,低溶点琼脂糖封闭,电泳参数：5 mA/胶 1 h,待溴酚蓝前沿移入SDS胶时,以30mA/胶6 h直至溴酚蓝前沿抵达距胶底边缘约0.5 cm时为止。

1.2.5 凝胶染色 根据蛋白质银染试剂盒的操作说明对2-D胶进行银染。用Proteineer SPSpectrometer扫描凝胶蛋白质获取图像,确定高度表达的特异蛋白质斑点。

1.2.6 蛋白质质谱鉴定 选取胶上差异蛋白质点,用刀片沿斑点染色边缘切下,置Eppendof管,按Gharahdaghi等方法进行蛋白质胶内酶解,37℃孵育过夜。萃取后,合并多肽混合物提取液。利用MALDI-TOF-MS质谱仪对肽混合物提取液进行分析,获得寡肽的质谱数据。将质谱数据输入MASCOT 2.2蛋白质数据库,对该蛋白质进行鉴定。

2 结果

通过LCM技术可以准确、快速地分离宫颈鳞癌细胞、间质组织,得到同质性肿瘤细胞。利用双向凝胶电泳对搜集获取的单一类型宫颈肿瘤细胞群和正常宫颈细胞配对样本进行分析后得到蛋白质凝胶电泳银染图谱。通过扫描凝胶影像,显示 20个蛋白点的表达量存在明显差异(P均 ＜0.01)。利用MALDI-TOF-MS成功鉴定出5种差异蛋白,其中ETS1、HSP60、Bcl-2、C-myc、TIF1-β蛋白在宫颈鳞癌细胞表达明显增高(P均＜0.05)。

3 讨论

目前认为,宫颈癌的形成是一个涉及正常细胞生长改变和基因改变的复杂的多阶段过程。本研究应用LCM和MALDI-TOF-MS技术,对高同质性宫颈鳞癌浸润组织细胞及正常宫颈组织细胞进行蛋白质组学的比较研究,成功鉴定出 5种差异蛋白,其中ETS1、HSP60、Bcl-2、C-myc、TIF1-β蛋白在宫颈鳞癌细胞表达明显增高。ETS家族是一类转录因子,在组织的变异、淋巴组织的增生和血管生成等方面发挥作用。ETS发挥作用时与其联合蛋白密切相关[3]。ETS-1蛋白的高表达可能与宫颈鳞癌的发生及浸润转移有关。HSP60蛋白定位于宫颈癌细胞的胞质中,在宫颈癌组织中过度表达[4],有可能成为宫颈癌早期诊断和治疗的重要标志。C-myc癌基因属核蛋白基因,具有转化细胞的能力,并具有与 DNA结合的特性,在调节细胞生长、分化及恶性转化中发挥作用[5]。本研究表明,Bcl-2蛋白在宫颈鳞癌细胞高表达,而正常宫颈组织细胞低表达,表明Bcl-2基因与宫颈癌的发生和发展相关。有报道[6],Bcl-2基因的过度表达并不影响细胞增殖,而是阻止细胞凋亡,使肿瘤细胞得以生存。本研究发现,TIF1-β蛋白在宫颈鳞癌细胞中高表达。TIF1-β是一种转录中介因子,在诸多转录调控复合体中起桥梁作用,参与形成具有组蛋白甲基化酶或组蛋白去乙酰化酶活性的复合体,通过中间的HP1BD区域与HP1蛋白相互作用,进而与组蛋白相结合[7]。

综上所述,本研究采用LCM技术成功获取了同质宫颈癌细胞和正常宫颈细胞,发现宫颈鳞癌和正常宫颈细胞的2-DE蛋白质图谱具有明显的差异表达,并成功鉴定出部分差异蛋白,该差异蛋白组可望作为宫颈鳞癌进展、转移和预后的潜在预测指标及治疗的分子靶点。

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