LCM、IMB联合MALDI-TOF-MS技术在恶性卵巢上皮瘤相关标志物分离检测中的应用

周 怡,王 琪,张 玮,李 力,＊

(1广西医科大学医学科学实验中心,南宁 530021;2广西医科大学附属肿瘤医院)

激光捕获纤维切割(LCM)技术可以根据形态学标准直观、准确和高效地从复合组织中特异性挑选出某一特定类型的细胞[1]。免疫磁珠(IMB)技术能使与磁珠上抗体特异性结合的抗原从其他物质中分离出来,在免疫检测、细胞分离、蛋白质纯化等方面均显示出良好的应用前景[2]。本研究采用 LCM联合IMB技术钓取恶性卵巢上皮瘤细胞中的特异性标志物黑色素瘤激活因子CXCL1及IL-8(1～77 aa)、IL-8(6～77 aa)和IL-8(9～77 aa),并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术进行了检测。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 正常、良性及恶性卵巢上皮瘤组织为 2006～2008年广西医科大学附属肿瘤医院留取的手术标本,经术后病理检查证实。恶性卵巢上皮瘤按照FIGO标准诊断为卵巢上皮癌,组织分级为 G2级,临床分期为Ⅲ～Ⅳ期。

1.1.2 主要仪器及试剂 快速冰冻切片机,激光捕获微切割显微镜,基质辅助激光解吸时间飞行质谱。IMB试剂盒,微量层析柱,CXCL1、IL-8抗体。TBO染液,动物细胞裂解液等。

1.2 方法

1.2.1 细胞捕获及其蛋白的提取 正常、良性及恶性卵巢上皮瘤组织冰冻切片的制备、染色及脱水过程如文献[3]所述。采用 LCM技术,每张切片平均捕获8 000 shottings。收集捕获细胞,-80℃保存。用动物细胞裂解液试剂盒提取捕获细胞的总蛋白,按说明书操作。

1.2.2 CXCL1及不同亚型IL-8分离 采用IMB技术。操作按说明书进行。

1.2.3 CXCL1及不同亚型IL-8蛋白样本的浓缩和脱盐 采用含C18填料的微量层析柱对CXCL1及不同亚型IL-8蛋白样本进行浓缩和脱盐。

1.2.4 CXCL1及不同亚型IL-8的检测 上述蛋白样品酶切消化成肽段后,多肽的串联质谱鉴定用MALDI-TOF-MS技术进行。

2 结果

捕获正常、良性及恶性卵巢上皮瘤细胞数分别为 1.32×106、1.40×106、1.28×106个。

M/Z为7 860的CXCL1在恶性卵巢上皮瘤细胞中表达,且表达丰度较高(纵轴指示intense＞104),在良性卵巢瘤和正常卵巢上皮细胞中均不表达。

M/Z约为8 930的IL-8(1～77 aa)在恶性和良性卵巢瘤细胞中表达,在正常卵巢细胞中不表达; M/Z约为8 360的IL-8(6～77 aa)在恶性卵巢肿瘤细胞中表达,在良性和正常样本中不表达;M/Z约为8 130的IL-8(9～77 aa)在卵巢恶性瘤细胞及良性或正常卵巢细胞中均不表达。另外,在经 IL-8 IMB获取的卵巢上皮癌样本中也发现 M/Z约为7 860的CXCL1,可能与CXCL1和其他CXC族趋化因子如IL-8、NAP-2、ENA-78、PF-4等具有较高同源性有关。

3 讨论

本课题组先期采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)分析比较卵巢恶性肿瘤与正常妇女外周血中的蛋白质谱表达差异,并构建诊断模型,筛选确定对早期诊断卵巢癌有价值的外周血蛋白质质谱,结果发现 M/Z为 7 869、8 136、8 386和 8 927的蛋白对卵巢癌早期诊断具有重要意义。采用HPLC液相系统和质谱技术对上述蛋白质予以纯化鉴定,发现它们分别为黑色素瘤激活因子CXCL1和IL-8的不同亚型,即IL-8(1～77 aa)、IL-8 (6～77 aa)和IL-8(9～77 aa)[4]。之后,我们采用双抗夹心ELASA法,应用商业化的CXCL1和IL-8抗体,检测其在 59例卵巢恶性肿瘤患者、64例卵巢良性肿瘤患者、142例健康妇女血清中的含量,结果显示,CXCL1和IL-8在卵巢恶性肿瘤患者血清中的平均含量极显著高于非恶性肿瘤人群(P＜0.01)。

Yang等[5]的研究认为,CXCL1可被致癌基因Ras诱导产生,CXCL1依赖p53途径诱导基质纤维原细胞凋亡,而基质纤维原细胞衰亡促进肿瘤生长,是正常卵巢上皮细胞转变为恶性肿瘤细胞的必要途径。Dannenmann等[6]也在卵巢癌组织和快速增殖的卵巢癌细胞株中检测到 CXCL1,进一步证实CXCL1可促进卵巢癌细胞增殖。

由于蛋白质水解酶剪接IL-8的N末端编码氨基酸序列位置不同,形成 6种氨基酸序列长度不同的IL-8亚型,其多肽序列分别为第 1～77、第5～77、第 6～77、第 7～77、第8～77、第 9～77氨基酸残基,这些亚型都具有生物学活性,但不同亚型的 IL-8诱导中性粒细胞的趋化和脱颗粒的能力是不同的[7]。采用质谱技术则可以发现不同亚型IL-8在卵巢癌细胞或血清等中的差异。

本研究采用LCM、IMB联合MALDI-TOF-MS技术,有效地获取了卵巢上皮癌细胞的特异标志物CXCL1及不同亚型IL-8,并准确地对其进行区分。我们将继续深入研究CXCL1、不同亚型IL-8的定位及其在卵巢组织上皮细胞中的相对表达量,并进一步探讨其在卵巢恶性肿瘤早期诊断中的价值。

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