霉菌教学标本片的制作及体会

杜银香

湖北民族学院医学院(湖北 恩施 445000)

霉菌的形态结构观察是微生物实验教学的一个重要内容，也是对霉菌进行分类鉴别的重要依据之一。观察霉菌形态的方法主要有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃纸培养观察法[1]。以往我们观察标本时多采用直接制片观察法中的水浸片，因为有液体的存在，故标本片保存的时间有限。我们在长期的实验教学中发现了一种简便的、可以长时间保存的、也很容易大批量制作霉菌标本片的方法，特介绍如下。

1 材料与方法

1.1材料(1)菌种：总状毛霉(来源于腐乳中，经分离鉴定为总状毛霉)。 (2)培养基：沙氏琼脂(生产批号20100520 杭州微生物试剂有限公司)。(3)仪器设备及其他：生物安全柜(Ⅱ级AC2-4S1 ESCO公司生产) ，恒温恒湿培养箱(型号XMT-9017重庆永恒实验仪器厂生产)，普通光学显微镜(型号BM1000 南京江南永新光学有限公司生产)，加拿大树胶、载玻片、盖玻片、眼科镊、解剖针等 。

1.2 方法

(1)玻片的清洗：新的载玻片、盖玻片因含游离碱，应先在1%盐酸溶液中浸泡24 h后，再用自来水冲洗干净，晾干后使用。

(2)结晶紫染液的配制：先称取结晶紫4～8 g，溶于95%乙醇100 mL中，制成结晶紫饱和液，再取此饱和液20 mL与1%草酸铵溶液80 mL混合，过滤后使用。

(3)菌种的准备：在生物安全柜内，利用孢子很容易飞散的特点，直接将长有总状毛霉的平板倒扣在需要接种的沙氏琼脂平板上，轻轻地敲击几下菌种平板，使孢子落到下面的平板上，放入温度25℃、湿度80%的恒温恒湿培养箱中培养，48 h后取出，看到气生菌丝呈白色，长约10 mm左右即可。

( 4)制片:在载玻片上1/3与2/3交界处滴加一滴生理盐水后，再用灭菌冷却后的眼科镊夹取突出在培养基表面的菌丝少许，轻轻地放入生理盐水中，用解剖针将菌丝分散开后，放空气中自然干燥或置25℃恒温恒湿培养箱使其干燥。

(5)染色:采用单染法，用结晶紫染液染色1 min后，水洗，洒去载玻片上多余的水份后，让其自然干燥或置25℃恒温恒湿培养箱使其干燥，待完全干燥后，盖上盖玻片，四周用加拿大树胶封片。

1.3结果在普通光学显微镜下可见孢囊梗及孢子囊、孢子囊孢子均成紫色。孢囊梗无横隔膜，最初不分枝，以后分枝，分枝长短不一，各分枝顶端均有孢子囊。 孢子囊呈球形，嫩孢子囊较小，染色较浅，成熟孢子囊较大，染色较深，还可见有些成熟孢子囊孢囊壁已经消解。孢子囊孢子呈卵形，表面光滑。

2 体会

2.1菌种准备时注意事项

(1)培养的温度：温度会影响菌丝的生长和代谢。在实践中我们发现如果取气生菌丝制作霉菌标本片，一般温度在25℃比较合适，在这个温度下培养48 h左右的气生菌丝较长，容易取材，并且孢子囊孢子的成熟度也不高。如温度过低，则菌丝生长太过缓慢，整个制作过程花费时间会太长。如温度过高，则菌丝会很快老化、死亡，产生的孢子囊孢子很快就会成熟破裂，大量孢子会释放出来，且附着在菌丝上，影响菌丝结构的观察。

(2)培养基的选择:我们在实验时发现,如果用培养细菌的营养琼脂去培养总状毛霉，总状毛霉的气生菌丝始终只有1～2 mm，不会太长，不适合取标本。营养琼脂和沙氏琼脂主要区别在于培养基的pH值不一样，前者pH为7.4左右，而后者的pH为6.0左右，pH也是影响菌丝的生长的一个重要因素，因此我们一般用沙氏琼脂来培养总状毛霉。

(3)氧气：总状毛霉在氧气充足的情况下气生菌丝生长良好。我们一般用沙氏琼脂平板来培养总状毛霉，并且培养时培养皿正立，培养皿的盖与底部之间留一丝缝隙，让其生长时氧气充足。

2.2制片注意要点

(1)尽量取呈白色的气生菌丝，不可用有黑点太多的菌丝，黑点太多，则说明产生的孢子囊孢子大多已经快成熟了，稍一接触菌丝，这些孢子囊会破裂。

(2)取菌丝时尽量取长一点，从接近培养基基质的地方开始取，菌丝不可取得太多，取得太多的话，菌丝很容易纠缠在一起，不容易分散开。

(3)菌丝放入到生理盐水中后就尽量不要去搅动它，否则大量的孢子囊也会破裂。

(4)载玻片上的生理盐水放得稍稍多一点，这样菌丝也就很容易浮在生理盐水的表面，菌丝自然就分散开了。

(5)制片时不能加热固定，加热后菌丝和孢子都会变形。

2.3染料的选择染色时我们尝试用细菌染色时常用的染料结晶紫和石炭酸复红分别进行单染，结果发现用石炭酸复红单染后菌丝和孢子都着色，但菌丝细胞收缩变形了，原因不明，有待进一步研究。用结晶紫单染的菌丝和孢子都着色，形态和用乳酸酚棉蓝染色后的效果没有区别，因此我们选择了用结晶紫染液。

2.4其他注意事项染色后水洗时一定注意不可直接打开水龙头冲洗，否则很容易将玻片上的菌丝及孢子冲掉。我们是将玻片轻轻地放入装有水的容器中，让水把紫色的染料慢慢地褪掉，看到没有紫色褪下即可；结晶紫染液配置好后一定要过滤，否则杂质易沾到标本片上，影响霉菌形态结构的观察；标本片的制备过程中需要注意生物安全，接种和制片时都需要在生物安全柜内进行。

[1] 曾松荣.细菌、霉菌玻片标本的制作技巧[J].生物学通报,2004,39(4)：52.