植物原生质体融合技术的研究进展

黄国文

(湖南科技学院 生命科学和化学工程学院，湖南 永州 425100)

植物原生质体融合技术的研究进展

黄国文

(湖南科技学院 生命科学和化学工程学院，湖南 永州 425100)

植物原生质体融合（protoplast fusion）技术能够克服植物远缘杂交不亲和的障碍，实现遗传物质重组,创造和培养植物新品种,对多基因控制农艺性状的改良和植物基因互作研究具有重要的意义。本文主要综述了原生质体融合方法、融合机理和融合方式等的研究进展，并且分析了其应用和发展前景。

原生质体；融合方法；融合方式；融合机制；应用

原生质体是指去掉了细胞壁后细胞膜所包围的裸露细胞。最早期利用机械法制备原生质体，将植物组织放在高渗糖溶液中浸泡一定时间，细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形；然后用机械破碎组织，一些完整原生质体从伤口处释放出来[1]，但用这种方法得到的原生质体的数量较少，且受植物种类的限制。1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体[2]。这种方法是把材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间来降解细胞壁，可以释放大量有活力的原生质体。目前，人们对原生质体的制备和培养进行了不少研究,而且对原生质体的融合也开展了大量的研究。原生质体融合在品种改良、基因转化和基因相互作用等生物工程领域得到了广泛的应用。

1 原生质体融合的目的和意义

两种异源（种、属间）原生质体，在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两个以上的异源原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成体细胞杂种。通过细胞培养技术，杂种细胞可进一步发育成杂种植物体。这个杂种后代有可能兼有两个亲代的一些优良性状。

原生质体融合可以克服远缘杂交时有性生殖不亲和性障碍，扩大了遗传物质的重组范围，创造有性杂交方法无法获得的新型杂种植物。通过原生质体融合可以从一个品种向另外一个品种转移一些有用的基因，例如，疾病抗性基因、固氮基因、抗冻和抗干旱等基因。原生质体融合技术可以将不同有机体的基因组合到一起创造适合人类需要的新品系，在植物、动物、工业微生物等领域创造新品种研究和基因互作研究中将会发挥重要的作用。

2 原生质体融合方法及其机理

广义上讲，原生质体融合分为自发融合和诱导融合两种。自发融合是指在分离原生质体期间原生质体经常自发地合并的现象[3]。在酶处理期间，来自邻近细胞的原生质体通过胞间连丝融合形成多核细胞，这种现象也是自发融合[4]。自发融合现象对于原生质体的分离是不利的。在融合诱导化学试剂的作用下不同来源的原生质体融合称为诱导融合。正常情况下，分离的原生质体彼此并不融合，因为分离的原生质体表面携带负电荷（10mV -30mV）围绕原生质膜的外部。原生质体的负电荷主要是由于膜内的磷酸基团产生的。因此，由于它们有同样的电荷，在原生质体之间有一个强大的相互排斥的趋势。因此，这种类型的融合需要一种融合诱导化学物质或者外力来减少原生质体的负电性，允许原生质体融合[5]。

诱导分离的原生质体融合主要有机械融合法、化学融合法和电融合法三种方法。

2.1 机械融合法

分离的原生质体在显微操作仪下产生紧密的物理接触而融合。

2.2 化学融合法

已经用了几种化学物质来使原生质体融合，如：硝酸钠、Ca2+、PEG和二甲亚砜（DMSO）等。化学融合剂引起分离的原生质体彼此粘附，导致紧密粘着产生融合[6]。化学融合是一种非特异性、费用低的、能够产生大量融合产物的融合方法，但是这种方法缺点是可能对细胞有毒、非选择性和融合效率低。

2.2.1 NaNO3融合法

1970年POWER等第一次描述了用0.25M NaNO3作为融合剂伴随离心促进玉米与燕麦原生质体融合[7]。1972年，美国研究者卡尔森（Carlson）等采用0.25M NaNO3诱导融合了粉兰烟草和郎氏烟草原生质体，培育出世界第一株体细胞杂种[8]。其方法是首先将分离的原生质体通过漂浮在10%蔗糖等渗溶液中清洁，转移这原生质体到含有 0.25M NaNO3的10%蔗糖溶液中。其次，在35℃的水浴中温育混合物。为了提高原生质体的融合效率，先将原生质体蔗糖溶液低速离心来促进融合，接着将沉淀悬浮后温育在水浴中，这步骤可以重复多次。然后，将含有融合的原生质体融合缓冲液通过用液体培养基稀释来取代，将原生质体温育到水浴中，这一步骤可以重复2次以上。最后，将干净的原生质体涂抹在固体培养基平板上，可以在倒立显微镜下观察细胞融合情况，也可以进行培养。

NaNO3诱导原生质体融合的机理是钠离子能中和原生质体表面的负电荷(-10～-30mV)，使原生质体不再相互排斥，凝聚原生质体，原生质体质膜靠近而融合[9]。但是这种方法的融合率低0.1%-4%，产生很少的异核体，并且原生质体的吸收能力改变。

2.2.2 高pH-高浓度钙离子融合法

一般情况下，与钠离子和钾离子比较，钙离子影响细胞融合的效率是很低的[10]，但是在高pH环境中高浓度钙离子会诱发融合效应。这种方法是凯勒（Keller）和梅尔切斯（Melchers）1973年为了融合两种不同的烟草原生质体发明的[11]，现在普遍使用。其方法是将分离的两个品系的烟草叶肉原生质体，混合在融合诱导缓冲液（0.05M CaCl2，0.4M甘露醇溶液，0.05M甘氨酸-NaOH缓冲液pH 10.5）中，50 g离心30分钟，在37℃水浴温育。原生质体马上聚集，在10min内发生融合，融合率可以达到 10%；水浴中温育 40-50min后，原生质体融合率可以达到 20-50%。但是这种方法仅仅适合叶肉原生质体的融合。这种方法的机理为，钙离子中和原生质体膜或细胞膜表明表面电荷，使聚集的原生质体的膜紧密接触，决定质膜的稳定性和可塑性；高pH能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。很多种间和种内的体细胞杂种就是使用这种方法产生的。值得注意的是,钙离子浓度和pH范围因植物种类不同而异。这种方法的高pH值或许对有些细胞是有毒的。

2.2.3 葡聚糖、聚乙烯醇（PVP）、合成的磷脂也用作细胞融合

1975年，Kanega用不同浓度的甘露醇处理烟草原生质体获得了20%以上的融合率；1978年，Nagata用15%聚乙烯醇+0.05mol/l氯化钙+0.3mol/1甘露醇组成的融合剂，成功地将烟草与大豆、烟草与萝卜等原生质体融合[12]。

2.2.4 PEG融合法

20世纪 70年代初，华裔科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合[13]。PEG是一种大分子（分子量 1000-6000）的水溶性的多聚化合物。一般地使用28-50%PEG溶液用于细胞融合。因为PEG液比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强，因此，在化学药品融合剂中，PEG作为细胞融合剂应用最为广泛，可以诱导高频率的异核体的形成。

一般使用两种实验方法完成原生质体融合。方法一，取大约0.6ml的PEG融合液(20～45%PEG,moL.wt.1500, 0.1M甘露醇、山梨醇或 蔗糖, 8-10 mmol CaCl2,和0.7mMKH2PO4，pH 5.6)以滴的形式添加到试管中的原生质体中。在盖好试管后，PEG中的原生质体在室温温育40min。偶尔旋转试管使原生质体接触。在每间隔10 min 后向试管中添加0.5-1ml的原生质体培养基来稀释PEG。离心除去融合液，将原生质体沉淀悬浮在培养液中。方法二，取两种原生质体（密度为 1×105个/毫升）混合液（比例为 1:1）0.1-0.5ml，静置 3～5min。首先加入融合液 A（2-8mM CaCl2，0.5-0.7mM KH2PO4，0.1-0.2mM 甘露醇或山梨醇，25%-30%PEG（wt.6000），pH 5.8）0.1-0.5ml，25℃保持15-20min；然后加入融合液 B（2-8mM CaCl2，0.5-0.7mM KH2PO4，0.1-0.2mM 甘露醇或山梨醇，pH 7.0-10.0）0.1-0.5ml，25℃保持10-20min，完成原生质体的融合；再用培养液洗涤（3～4次），离心（100×g）5min，可以用来观察和培养，这种 2 步融合法在实验室中广泛应用。有学者对PEG 介导的原生质体融合方法进行了改进，由原来的2步融合分为3 步，逐渐降低PEG 的浓度，逐步提高溶液中Ca2+的浓度和pH 值，微量化且省略了离心步骤，操作更简单[14]。

影响PEG融合法的因素有PEG的种类、纯度、浓度、处理时间及原生质体的生理状况和密度等。其中，PEG的分子量和浓度在诱导成功的融合中是关键的。分子量小于100的PEG不会产生紧密的粘连，然而分子量为6000的PEG在诱导融合时是非常有效的。但是，较高分子量的PEG会产生太粘的溶液而不容易被操作。低温(10)℃比常温( 25)℃下培养的原生质体融合的速度增加[15]。近年来一些研究建议在PEG溶液中加入融合促进剂(伴刀豆球蛋白、二甲基亚砜、链霉蛋白等), 可有效提高原生质体的融合频率。

PEG诱导原生质体融合的机理是，带有大量负电荷的PEG与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失，由于高度脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不同的凝集物，邻近的原生质体之间紧密接触；PEG带有大量的负电荷,能够结合Ca2+，与原生质体表面的负电荷连接，形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合；此外，PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键，在相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触。在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。当PEG被洗脱的时候出现原生质体融合，可能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂质与类脂质反应产生扰动和重排，导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大，两个原生质体最终融合[16]。

PEG诱导融合的优点是没有种间、属间和科间的特异性或者专一性，几乎可诱导任何原生质体间的融合，融合过程不受物种限制，所以这种方法使用广泛。PEG法的融合频率可达10%～15% ,融合实验成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高。但是也有缺点，融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒性，经验性大。

2.2.5 PEG结合高pH-高浓度钙离子融合法

20 世纪70 年代中期,Kao等建立了聚乙二醇( PEG) —高pH高钙法[16]。直到20世纪90年代,所获得的体细胞杂种大部分是用这种方法诱导融合产生的，是最有效的融合方法。

这种融合方法的操作步骤是，取原生质体悬浮液约1mL(各0.5mL) ,滴入直径为6 cm的培养皿中间的18 ×18mm2盖玻片上或直径为1.5 cm的玻璃离心管中,静置5min待形成薄层原生质体后,加入等量的 PEG液(0.1-0.2M 蔗糖, 0.17mM KH2PO4, 10.0 mM CaCl2•2H2O, 20-40% PEG6000 (W /V),10% DMSO (W /V), pH 5.2-5.8),静置约15-25 min后加入2-3 ml高 Ca2+高 pH 液(300mM 葡萄糖, 50mM CaCl2•2H2O,50mM 甘氨酸- NaOH缓冲液 pH 10.5),处理10-20min,添加洗涤液离心洗涤3次(700 rpm, 5 min),再用培养液洗涤2～3次，最后，将融合体用培养液悬浮,于原皿中进行液体浅层培养或转入小培养皿中进行固体平板培养(固液比为11)∶[17,18]。有学者对这种方法进行了改进,用Ca(NO3)2代替CaCl2，并省略了离心步骤，微量化操作，在草木樨状黄芪和木本霸王之间诱导融合得到了科间融合细胞[19]。

其作用机理是，在高Ca2+和高pH溶液的作用下，将高钙离子与质膜结合的PEG分子洗脱，将进一步加剧电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体，从而提高融合几率。

虽然多种化学试剂已经被广泛用于原生质体融合，但是它们存在一些缺点。各种植物原生质体之间融合过程和融合剂浓度可能存在差异，融合效率是可变的，并且各种融合剂对原生质体可能产生毒害作用。所以用物理的电融合法来融合原生质体是一种趋势。

2.3 电融合法

20世纪80年代齐默曼（Zimmerman）等建立电场诱导细胞融合技术。这是一种更具有可重复性的原生质体融合方法[20],是目前最流行的物理诱导融合方法[21]。

电融合法有2个步骤，(1) 将待融合的原生质体在低导电率融合液中混合，取约100 μl悬浮在两极之间，将融合小室接好电极后至于倒置显微镜下，施加高频 (0.5-1.5MH2)、场强为30v-300v/cm 的交流电场，处理时间为20s-1min。 在非均匀交流电场（可变电场）中，原生质体的表面电荷发生极化，原生质体偶极化而沿电场线方向泳动, 并相互吸引形成与电场线平行的原生质体链；(2) 施加一次或多次瞬间(10-100µS)直流高压电脉冲(1-3Kv / cm)，脉冲宽度为40-60μs，每次间隔 1s，使质膜可逆性击穿，互相接触的质膜瞬间被电击破后, 又迅速连接闭合, 恢复成嵌合质膜形成融合体[22]。静置融合小室 20-30min，在倒置显微镜下观察融合过程。在原生质体开始融合时, 应短时重复施加交流电场以保持原生质体间的紧密结合状态, 然后使电场强度慢慢降至零。

电融合法的分子机制为，通过交流电脉冲，原生质体成链，两细胞膜紧密接触，且膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白的类脂区。在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，膜结构局部扰乱，形成小孔。而相对的脂双层间分子在范德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接处的细胞膜表面曲率大，处于高张力状态，最终导致两细胞逐渐融合成一个大的球状细胞。影响电融合的效果主要是电压大小、持续的时间和原生质体的尺寸[23,24]。

与PEG法比较，电融合法有许多优点。诱导仅发生在质膜接触部位，对细胞毒害作用小，大大提高了融合频率(60%～80 %)[25]，在燕麦和烟草等原生质体产生融合率可达60% 以上20；融合参数容易控制，操作简便,可在显微镜下观察融合的全过程，重复性强；融合过程在几分钟内完成，同步性好，活细胞数目多；电融合在保持原生质体的活力,减少细胞膜的损害和原生质体的畸变和破裂等方面都要好于化学融合。但是电融合法需要昂贵的电融合仪, 因此目前仍不如化学法适用普遍[26]。

总之，不管是化学融合法还是电融合法，原生质体之间的融合是由于相互接触的原生质体的膜脂相互作用产生膜脂重排、融合，最后形成了融合的细胞。在化学融合法加入Ca2+可以引起质膜上的界面动电位还原，中和了膜上的负电荷，导致膜内接触，诱导膜融合[27]。另外一些解释认为，当原生质体紧密粘连时，外源的融合剂引起分布在细胞膜内的蛋白和糖蛋白上。这样增加了膜的流动性并且产生了油脂分子混入的区域，容许相邻膜的合并。大分子聚合物 PEG（1000-6000）作为一个连接原生质体之间的分子桥起作用，并且增加了流动性。当两个原生质体分子距离等于或者小于10 Å 时，原生质体发生融合，表明原生质体融合是一个高度创伤性的事件[22]。

在促融合剂作用下原生质体的融合过程是，原生质体先出现凝集现象，然后部分凝集细胞之间的膜产生粘连，发生膜融合形成多核细胞。在培养过程中多核细胞又进行核的融合而成为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。

3 原生质体融合的方式

原生质体的融合方式常见的有对称融合和非对称融合两种。通过这两种融合方式可产生对称杂种、非对称杂种和胞质杂种3种类型。另外还有一类杂种叫异质杂种。同时, 还有配子-体细胞融合和亚原生质体- 原生质体融合[28]。

两个完整的原生质体之间的融合是对称融合，它结合了两个参与者的完整基因组。通过原生质体对称融合，已经成功地从野生性转移了一些重要抗性到融合植株中[29,30]。原生质体的对称融合中，除了有重要农艺性状的基因以外，有害的基因也转移到了融合植株体内。此外，对称融合得到的多倍体杂种, 实现了不同种间、属间甚至族间的遗传重组, 但倍性升高后导致一些经济性状的下降, 因而原生质体融合得到倍性不增加的二倍体胞质杂种是植物细胞工程领域的研究方向之一[31]。为达到这个目的，19 世纪80年代以后,采用非对称融合方式, 既可以克服育种障碍又不增加杂种倍性。

利用物理或化学方法使一个亲本的核失活，再与另外一个完整的细胞进行融合方式称为不对称融合。一般用射线(X射线或γ射线) 、紫外线等照射的核失活原生质体作为供体，射线照射打断了完整的染色体结构，导致核失活，细胞不能分裂；用代谢抑制剂如碘乙酸( IA) 、碘乙酰胺( IOA) 、罗丹明- 6G( R- 6G) 等处理的原生质体作为受体，抑制细胞的能量代谢，使细胞质失活，细胞不能生长；当供体和受体融合形成融合体发生互补后才能生长，从而筛选出杂种。该法有可能免除杂种细胞的筛选过程[32]。例如：用紫外线（UV）照射过的花烟草叶肉原生质体与 0.25mM 碘乙酸钝化后的烤烟品种K326叶肉原生质体，经PEG法融合、再生植株，获得的再生植株可能有受体亲本全套核基因和供体亲本的部分染色体[33]。用软 X 射线(0.1167 Gy/s)照射过的疣粒野生稻原生质体作供体, 2.5 mmol/L碘乙酰胺(IOA)处理15min后水稻栽培品种 02428 的原生质体经作受体，进行不对称融合，经过PEG法得到栽体细胞杂种，表明疣粒野生稻对水稻白叶枯病的抗性成功地转移到栽培稻中[34]。

不对称融合有意识地去除（或杀死）某一亲本的细胞核，与另一亲本的胞质或者完整原生质体杂交，得到一个亲本细胞核与另一亲本的胞质或者两个亲本细胞质的体细胞杂种称为胞质杂种。胞质杂种可以通过三种途径产生：一个正常的原生质体和一个去核的原生质体融合；一个正常的原生质体和一个核失活的原生质体融合；细胞对称融合以后某一阶段一个亲本的核或染色体被排除[31]，但是这种情况具有一定的偶然性。胞质杂交可用来转移细胞质基因所决定的遗传性状，如胞质雄性不育特征，对某些抗生素的抗性，以及一些与光合作用有关的特性等。不对称融合只有DNA重组而没有额外的染色体的作用,避免了胞质基因供方的野生性状进入杂种，其遗传性状稳定,有希望成为直接用于育种的一种有效途径[35]。

4 展望

植物原生质体融合技术以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合成杂种细胞，杂种细胞再生成植株，为植物育种和基因互作研究提供了条件。诱导原生质体融合的方法化学融合法和物理的电融合法。目前广泛使用PEG法和电融合法，并发展出微融合法。电融合法与微培养法相结合，建立了单对原生质体融合技术程序,解决了融合细胞的选择问题，是一种有前途的技术。目前正在研究用电脑控制进行自动化操作，以提高操作效率。在融合烟草原生质体时使用激光融合法避免了亲本原生质体中叶绿体分布的影响[36]，是近年来比较新的一种方法，但是目前聚集微素激光法应用很少。

利用细胞的全能性，融合细胞可以被诱导再生成植株，可以培育异核体杂种。作物的优良性状往往受多基因控制，基因工程很难实现多基因转移，而原生质体融合为一次性多基因性状的改良提供了途径,并且为生物远缘杂交提供了一条途径。对称融合在导入有用基因的同时，也带入了新的全部不利基因，所以采用不对称融合来转移特定的性状是一个研究方向。遗传物质有少量遗传基因存在于细胞质内，如雄性不育基因、抗除草剂基因就存在于细胞质的叶绿体及线粒体上。利用原生质体不对称融合已成功育出了具有雄性不育特性的油菜、水稻细胞质杂种。随着不同植物胞质体分离技术的成熟， 胞质体-原生质体融合形成胞质杂种将会在胞质基因组改良方面发挥作用。

目前，通过体细胞杂交技术研究，不仅创造了许多融合方法和融合方式，而且对杂种细胞的筛选以及杂种植株的鉴定和培养进行了大量的工作，取得了很大进展，但是也存在一定的不足。原生质体杂交需要筛选杂种细胞，杂种细胞再生能力差，杂种植株性状较差(不育、生根能力差、生长势较弱等)是原生质体融合技术中的主要问题。因此，需要研究诱导融合及杂种细胞的各种生理生化和遗传机理。开展各种植物的原生质体再生技术研究。探索外源遗传物质导入原生质体的条件及研究其在原生质体中的表达机制。研究杂种细胞培养和杂种植株的鉴定。将原生质体融合与遗传转化、常规杂交等育种方法结合起来, 更有效地转移优良性状, 创造优异种质，使这一技术成为研究植物改良和基因相互作用的一种有效的手段。

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Q2-3

A

1673-2219（2011）12-0030-05

2011－03－20

黄国文（1965－），湖南郴州人，博士，从事细胞工程技术教学和科研工作。

(责任编校:何俊华)