猪伪狂犬病病毒检测方法研究进展＊

郭广君，吕素芳，肖跃强，毕研丽，魏 凤，，沈志强，，丁 壮

（1.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春 130062；2.山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技术重点实验室，山东滨州 256600；3.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600）

伪狂犬病是危害养猪业的主要传染病之一，给全世界的养猪业造成了巨大的经济损失。伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）也称为猪I型疱疹病毒（Suis herpesvirus 1）或 Aujeszky＇s病毒，它与人单纯疱疹病毒（HSV－1、HSV－2）和水痘带状疱疹病毒（VZV）、牛疱疹病毒1型（BHV－1）、马疱疹病毒1型（EHV－1）以及鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）同属于疱疹病毒科（Herpesviridae）的α疱疹病毒亚科，其宿主范围很广，能有效感染除高级灵长类外的哺乳动物和一些禽类，猪是其自然宿主和传染源之一。PRV能引起多种家畜及野生动物以发热、奇痒（除猪外）和脑脊髓炎为主要症状的急性传染病，并可在猪体内建立潜伏感染。

随着免疫学与分子生物学技术日臻完善，猪伪狂犬病的现代疫苗研究有了长足的发展，相关的血清学方法和分子生物学诊断方法也不断完善，本文就近年来针对猪伪狂犬病病毒的检测方法做一综述。

1 血清学方法

1.1 中和试验

中和试验（neutralization test，NT）又称微量血清 中 和 试 验 （mircoserum neutralization test，MSNT），作为病毒检测的经典方法，是世界上多数国家诊断PR的法定方法之一。将标准病毒株与连续倍比稀释的等量血清混匀后，37℃中和1h，接种在96孔微量培养板上的单层猪肾继代细胞（PK－l5）或鸡胚成纤维细胞，置37℃、体积分数为5%CO2培养观察细胞病变（CPE），以能完全中和病毒的血清最高稀释度的倒数为该血清的中和效价，中和效价大于或等于1∶2的判为阳性。方六荣等［1］用MSNT进行了PRV的血清学调查。通过监测中和指数和中和效价，发现MSNT的特异性很强，但敏感性较低。如果延长抗原与血清的孵育时间，尤以补体存在时，可使其敏感性增高。NT有较高灵敏度，是一种常用的诊断方法。由于该法操作繁琐，工作量大，且受技术、细胞等条件限制，给临床应用带来一定的困难。

1.2 酶联免疫吸附试验

酶 联 免 疫 吸 附 试 验 （enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）具有快速、简便、特异性强、敏感性高的优点，可用于大批量样品的检测，IgM－ELISA还可早期检测。世界动物卫生组织（OIE）将其作为诊断猪PR的首选血清学方法。美国也将ELISA作为PR的3种法定诊断方法之一。

随着近年来基因工程缺失疫苗的研制成功，我国陆续建立了针对野毒与疫苗毒株的鉴别诊断方法。唐勇［2］在克隆表达的基础上建立了gG－LAT、gG－ELISA和gE－LAT、gE－ELISA。结果表明，gGLAT和gG－ELISA特异性强、敏感性高，可用于区分gG基因缺失疫苗活苗免疫猪与自然感染野毒的血清学阳性猪；gE－LAT和gE－ELISA特异、敏感且重复性好，能显著区分gE基因缺失疫苗免疫猪血清和野毒感染猪血清，可用于猪伪狂犬病的鉴别诊断。汪招雄等［3］以猪伪狂犬病病毒（PRV）Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体，纯化的抗PRV IgG为检测抗体，建立了检测PRV抗原的双抗体夹心ELISA方法。结果表明，双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可广泛应用于动物组织中PRV的检测。Gut M 等［4］构建了直接竞争 ELISA （gE／gI－ELISA），试验证明gE／gI ELISA比gE－ELISA的敏感性和特异性更强，还可用于检测感染2周龄的早期感染猪血清中的抗体。Gut M 等［5］构建了直接夹心BacgB ELISA，结果证明此法具有较高的特异性和敏感性，最早可以检测感染7d后猪血清中的gB抗体。感染猪体内可以检测到母源抗体，还可用于检测包括gE缺失在内的疫苗毒与自然感染毒。Ao J Q等［6］将毕赤酵母表达的gE蛋白作为包被抗原，建立了间接gE－ELISA方法，与商业的gE－ELISA方法相符程度无显著差异（P＞0.05）。罗飞［7］以在大肠埃希菌中高效表达的伪狂犬病毒gB重组蛋白作为抗原，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗猪IgG为二抗，建立了针对血清gB抗体的间接gBELISA，该方法敏感性和特异性分别为75%（27／36）和80.7%（67／83），符合率为79%（94／119）。

1.3 乳胶凝集试验

乳胶凝集试验（latex agglutination test，LAT）利用抗原抗体特异性结合的性质，先用乳胶包被抗原，再与相应血清反应，如几分钟内发生凝集，可判定有PRV感染。唐勇［8］在克隆表达的基础上建立了 gG－LAT、gG－ELISA 和 gE－LAT、gE－ELISA。结果表明，gG－LAT和gG－ELISA特异性强、敏感性高，可用于区分gG基因缺失疫苗活苗免疫猪与自然感染野毒的血清学阳性猪；gE－LAT 和gEELISA特异、敏感且重复性好，能显著区分gE基因缺失疫苗免疫猪血清和野毒感染猪血清，可用于猪伪狂犬病的鉴别诊断。美国已经有商品化的LAT试剂盒供临床使用，LAT操作简单、方便、快速，且敏感性高、特异性强，适用于疫病监测或流行病学调查，以及种猪群检疫净化阳性猪初次筛选。

1.4 血凝试验与血凝抑制试验

吴平等［9］用单克隆抗体致敏绵羊红细胞建立了反向间接血凝抑制试验（HI），与MSNT符合率为94%。廖文军等［10］以纯化的抗人红细胞单链抗体（ScFv）－PRV gE蛋白双功能融合蛋白为抗原，建立了检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的红细胞凝集试验。与美国进口的PRV抗体检测gE－ELISA诊断试剂盒比较，阴、阳性检出符合率均为100%。红细胞凝集试验检测方法具有操作简便、敏感性和特异性较高的特点，可用于PRV野毒感染的快速筛查。

1.5 胶体金免疫层析

白静等［11］利用PCR技术从PRV基因组中克隆gE抗原表位基因，将其插入到载体pET－22b（＋）中，构建成原核表达质粒，并在E.coliBL21（DE3）中诱导表达，表达产物纯化后作为抗原，结合胶体金标记技术，应用双抗原夹心法于国内首先建立了猪PRV gE抗体检测的免疫层析试纸条。该方法操作简单、灵敏度高、特异性好，适合猪伪狂犬病的临床诊断。廖文军等［12］以纯化的抗人红细胞单链抗体（ScFv）－PRV gE蛋白双功能融合蛋白为诊断抗原和胶体金标记物，以羊抗猪IgG包被硝酸纤维膜作为质控带，制作检测PRV gE抗体的双抗原胶体金试纸条。试纸条在室温保存6个月，其特异性和敏感性没有明显变化；与美国IDEXX和法国LSI gE－ELISA抗体检测诊断试剂盒检测结果比较，1 164份猪血清的符合率均为90.55%。制备的胶体金试纸条具有操作简便、敏感性和特异性较高的特点，可用于PRV野毒感染的快速筛查。

2 分子生物学方法

2.1 核酸探针

郭万柱等［13］用斑点杂交法应用32P标记PRV全基因组DNA和重组质粒作探针检测细胞培养物中的PRV－DNA，均能检测10pg的PRV－DNA且有较高特异性。王琴等［14］以非放射性生物素标记DNA探针检测伪狂犬病病毒，且与郭万柱报道的结果一致。魏伟等［15］用光敏生物素标记PRV特异性糖蛋白GP50克隆重组颗粒PUP作为探针，检测试验感染乳猪15头份，证明通过PCR和分子克隆技术制备的PRV特异性糖蛋白基因片段的光敏生物探针能有效地用于检测伪狂犬病病毒。刘志杰等［16］利用PCR技术扩增gE基因片段，制备了地高辛标记的gE基因核酸探针，特异性好，对PRV野毒的最低检出量为4pg，敏感性高，与PCR检测结果一致，表明该核酸探针可用于猪伪狂犬病野毒感染的临床诊断。

2.2 基因芯片

张焕容等［17－18］对伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和日本脑炎病毒（JEV）检测基因芯片的制备及该芯片的检测技术进行了研究。取其中13个靶基因PRV gB、gG、TK和gE，PPV NS2、NS3、VP1和VP2以及JEVC、PrM／M、E、NS1和NS5制备PRV、PPV和JEV检测基因芯片，结果制备的芯片质量好，检测的灵敏度为3pg／μL，特异性强，芯片可重复使用，芯片批间重复性好。该芯片可同时检测PRV、PPV和JEV，可区分伪狂犬病病毒野毒和基因缺失疫苗毒。符芳等［19］将猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV－2）的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上，以这5种细胞毒的核酸作为模板，建立了基因芯片探针检测方法。结果显示，该芯片探针可以特异地与Cy3标记的这5种靶物结合。用该基因芯片对100份现场采集的猪全血样品进行检测，检出PRRSV阳性样品26份，PCV－2阳性样品47份，PRRSV和PCV－2混合感染阳性样品17份，PPV阳性样品5份，PRV阳性样品2份，CSFV阳性样品20份。表明研制的cDNA芯片探针可以特异地检测这5种猪病病毒，具有良好的诊断应用前景。

2.3 PCR方法

2.3.1 多重PCR PCR方法以其快速、敏感、易于操作等优点在近年来被广泛应用，检测PRV与其他猪病毒病的多重PCR方法也相继建立。潘群兴等［20］建立了一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV－2）、猪细小病毒（PPV）及猪伪狂犬病病毒（PRV）疫苗株与野毒株的多重PCR方法。该方法敏感性较高，特异性好，对临床上进行这3种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具重要意义。曲光刚等［21］建立了PRV、PPV双重PCR检测方法，具有良好的特异性和敏感性，省时、省力、快速、高效、敏感。岳丰熊［22］建立了一种能够同时检测PCV－2、PPV、PRV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的多重PCR方法（mPCR）。结果表明，该方法具有很好的特异性和敏感性，对临床上PCV－2、PPV、PRV、PRRSV的鉴别诊断以及这4种病毒的流行病学调查具有重要意义。Huang C等［23］建立了快速检测PRV、PPV、PCV－1和PCV－2的多重PCR方法，通过不同PCR组合可以从淋巴结、肺脏、脾脏、扁桃体等组织检测到一种或多种病毒，敏感性和特异性较高，可作为分子生物学诊断的常用方法。Lee C S等［24］建立了可同时检测猪体内伪狂犬病病毒、细胞巨化病毒和猪圆环病毒的多重PCR方法。Yue F等［25］建立了快速检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重PCR方法。多重PCR将成为分子生物学检测和流行病学调查的常用方法。

2.3.2 实时定量 PCR 赵丽等［26－27］根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列，建立了实时定量荧光PCR方法。结果表明，该方法具有快速、特异、敏感、可定量，并可同时检测大量样品等优点。吕建强等［28］根据GenBank中登录的伪狂犬病病毒gD基因序列，选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针，通过对实时荧光PCR反应条件进行优化，建立了用于检测伪狂犬病病毒的实时荧光PCR方法，灵敏性试验发现，其最低检测限可达1.42 pg／μL的总DNA，其敏感度比PCR至少高10倍。李明凤等［29］利用PCR技术扩增PRV gH基因的187bp片段，建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，该方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于临床PRV感染的检测。Ma W等［30］根据PRV gB和gE基因分别设计引物和探针，建立了快速检测区分伪狂犬病毒野毒与基因缺失疫苗毒的实时荧光定量PCR方法，能快速、特异检测感染和潜伏感染野猪体内的PRV。Zhao L等［31］根据PRV gH，gE基因设计两对引物及相应的探针，建立了区分伪狂犬病野毒与疫苗毒的荧光定量PCR诊断方法，结果表明，建立的FQ－PCR方法快速、敏感、特异、精确，可广泛用于PRV野毒检测，为早期快速诊断和定量分析PRV的感染程度奠定了基础。Tombácz D 等［32］建立了实时定量RT－PCR方法，从感染PK－15细胞中提取PRV全基因组检测RNA，以一种新的方式计算相对表达量，通过表达动力学比较不同的PRV基因并进行分类，首次通过qRT2－PCR方法进行基因表达研究疱疹病毒全基因组。

2.3.3 LAMP方法 环介导等温扩增（loop－mediated isothermal amplification）是一种新兴的快速扩增技术，非常适合于现场检测。自建立以来，其在反应速度、产物检测和引物设计等许多方面又得到了进一步的改进和发展，使其性能更优异，用途更广泛。En F X 等［33］根据 PRV 的 DNA－结 合 蛋 白（DBP）基因设计6条引物，建立了检测PRV的LAMP方法。最低检测量达10fg DNA，比普通PCR灵敏度高100倍～1 000倍，而且特异性好。采取5份临床样品同时进行LAMP和PCR检测，相关性高。Zhang C F等［34］根据gE基因设计一组引物检测野毒株，根据gG或gE基因设计另一组引物检测gE－疫苗毒和野毒，建立了用于快速检测区别伪狂犬病野毒与基因缺失疫苗毒的LAMP方法。结果表明，比普通PCR灵敏100倍～1 000倍，具有特 异 性，PPV、PCV－1、PCV－2、PRRSV、CSFV、TGEV、PEDV等猪的病毒未扩增出。LAMP方法因其敏感性、特异性、操作简单，将成为早期快速鉴别区分PRV gE缺失疫苗与自然感染野毒的方法。

4 展望

对病原快速而准确的检测是防控当今威胁畜牧业各类传染病的关键措施。目前用于PRV感染的诊断方法很多，各有优缺点。血清学检测手段，尤其是研制成功的LAT和针对主要抗原蛋白gE、gB、gD建立的ELISA试剂盒操作简单、方便，不需要使用昂贵复杂的仪器，可以在基层组织中广泛应用。特别是近年来随着单抗技术和基因扩增技术的日臻完善和改进，胶体金试纸条研制和LAMP技术方法的建立与应用使基层现场直观的检测成为可能。

分子生物学方法灵敏度高、特异性好，随着条件的完善将会越来越广泛应用。多重PCR和套式PCR的应用提高了检测疾病的特异性和敏感性，可以用于大批样品的检查和流行病学调查；而核酸探针方法灵敏度高，可以达到pg级，是目前灵敏度最高的检测方法，但是其试验操作步骤较为复杂而繁琐，可以用于实验室检测和判定。当然，无论哪一种方法都不能彻底解决所有的问题，可以根据检测的目的和要求，选择最适宜的检测方法或将几种检测方法组合起来应用，做到早发现，力争从根本上解决该病的防控问题。

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