寄生虫半胱氨酸蛋白酶研究进展＊

宋军科，才学鹏，骆学农，林 青，窦永喜，于三科＊

（1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室 甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃兰州 730046）

半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases，CP）约为21ku～30ku，在pH 4～6.5时水解活性最高［1］。CP在生物进化过程中是非常保守的酶系，不同的生物物种之间的半胱氨酸蛋白酶有一定的相似性，同一物种的不同半胱氨酸蛋白酶也有结构相似的现象，这些结构特点相似的酶构成了一个蛋白酶家族，称之为caspase（cysteine aspartic acic specific protease）家族。在1879年第一个纯化和确认的半胱氨酸蛋白酶取自番木瓜果（carica papaya），因而命名为木瓜蛋白酶（papain）。以后发现许多与木瓜蛋白酶有相似序列的蛋白酶，统称为木瓜蛋白酶样蛋白酶（papain like protease）或CA蛋白酶族。寄生虫半胱氨酸蛋白酶大多属于CA族内的C1族（组织蛋白酶B cathepsin B和组织蛋白酶L样蛋白酶cathepsin L－like）和C2族（钙激活蛋白酶样蛋白酶）［2］。长期以来，对CP的种类、来源、结构及其功能进行了多方面的研究，已经认识到其广泛分布于从病毒至脊椎动物的生物体中，当然动物和人的寄生虫也会不例外，这些蛋白酶已经被证实在寄生虫的发育和生存过程中发挥着各种各样重要的作用。经过许多科研工作者过去几十年在寄生性蠕虫和原虫方面的研究，揭示了这些由寄生虫分泌的蛋白酶不仅是寄生虫入侵组织的因子之一，其也可能在寄生虫营养、免疫逃避和蜕皮等方面有重要作用［3－5］。因此，寄生虫的半胱氨酸蛋白酶已经在研发新的抗寄生虫药物和抗寄生虫疫苗的目标方面得到了关注。

1 寄生虫半胱氨酸的来源及存在的部位

在寄生生物中存在有分泌的蛋白水解酶，说明这些酶对于寄生虫进行各种必需的机制是非常需要的。组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶已经在很多种寄生虫体内被发现，而且组织蛋白酶L在寄生虫的所有发育阶段都会被分泌。寄生虫半胱氨酸蛋白酶的分泌或存在的部位在不同虫种以及同一虫种不同虫期均有差异。肝片吸虫，卫氏并殖吸虫的半胱氨酸蛋白酶在肠上皮细胞中合成，集中于分泌小泡，通过分泌小泡释放到肠腔中［6－7］。巴西日本圆线虫的半胱氨酸蛋白酶活性不仅存在于虫体抽提物中，也存在于其排泄分泌物中。曼氏血吸虫的组织蛋白酶B和L1样半胱氮酸蛋白酶存在于成虫皮层（尤其是雄虫的腹侧皮层）和盲肠的肠表皮细胞［8］。疟原虫半胱氨酸蛋白酶存在于胞内酸性食物泡中［9］。

寄生虫的半胱氨酸蛋白酶在寄生虫的多个部位及各个发育阶段均可产生或存在，目前研究人员所获得的半胱氨酸蛋白酶来源一方面来自于虫体组织提取物或分泌代谢产物，而另一方面则应用分子生物学方法通过对半胱氨酸蛋白酶的基因进行克隆，表达而获得。

2 半胱氨酸蛋白酶的分泌机制

许多感染哺乳动物宿主的单细胞寄生虫和多细胞寄生虫产生多种蛋白酶，其中一些是通过分泌方式产生的。组织蛋白酶L在寄生虫的所有发育阶段都会被分泌，片形吸虫排泄分泌物（excretion／secretion，E／S）的一个重要组成部分就是有一类半胱氨酸蛋白酶，它们的分子量大小在26ku～30ku之间，这些酶通过吸虫成虫和幼虫的肠表皮分泌。免疫细胞化学研究说明这种酶被做为无活性的前酶—前组织蛋白酶L贮存于肠表皮上皮细胞中，再通过自身催化前组织蛋白酶L表现出活性，然后分泌到寄生虫肠内腔中的酸性环境中，在此有活性的蛋白酶起到消化食物的功能［10］。由于寄生性吸虫的肠管为盲肠，因此，未消化产物靠回流到口孔（约每3h一次）排出。通过这种方式，有活性的成熟组织蛋白酶L被定期地释放出来，以充分发挥其作用。组织蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶在吸虫成虫体内被大量合成（每成虫每小时0.5μg／～1.0μg），从分泌小泡内物质的合成到释放到肠内腔中的更新率是非常快的，大约每小时一次［11］。

3 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫免疫逃避、营养获得与移行方面的研究

3.1 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫免疫逃避中的作用

当研究发现肝片吸虫E／S产物能将IgG重链切割的用作以后，人们认识和预测到组织蛋白酶在宿主免疫免疫逃避中的作用。认为这些酶可能会阻止抗体活性效应功能，比如可以阻止补体结合在移行中的吸虫附近，为虫体免受免疫攻击提供保护。体外试验也证实了嗜酸性粒细胞不能进行或者不能维持抗体介导对幼虫阶段包囊的结合能力，寄生虫在体内分泌的这些酶可以保护它们免受宿主免疫反应的破坏。另一方面，寄生虫通过自身分泌的蛋白酶加速其皮层和组织的更新与代谢以阻止宿主免疫系统的识别［12］。另外，一些寄生虫的半胱氨酸蛋白酶也发现有通过诱导IL－4抑制Th1免疫的作用。Machado D C等［13］证明了这些蛋白酶甚至在没有特异性免疫球蛋白存在的情况下，也可活化肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒并分泌IL－4。缺乏半胱氨酸蛋白酶的墨西哥利什曼原虫能在Balb／c小鼠体内诱导Th1免疫反应，小鼠也很少遭受感染，且不能使小鼠生长受到损害［14］。片形吸虫在牛、羊和人等许多宿主体内可导致一种慢性肝病。与其他寄生虫一样，肝片吸虫产生一种严重的Th2反应，并且能抵御宿主免疫反应的持续攻击，在它的终末宿主体内长时间存活［10］。

片形吸虫感染过程期间，在哺乳动物宿主体内发育的寄生虫的所有阶段中都有组织蛋白酶L的释放，其中穿过肠壁的新感染的包囊幼虫阶段也可释放此蛋白酶［15］。目前研究认为，肝片吸虫通过利用诱导的半胱氨酸蛋白酶对CD4进行切割，这可能是肝片吸虫用来抑制淋巴细胞增殖的机制之一，这种机制在绵羊体内有助于虫体逃避对宿主的免疫系统并有助于感染的建立。已经证实了肝片吸虫的感染能抑制 Th1反应［10］。

3.2 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫获取营养与移行中的作用

从宿主组织降解开始，摄食与移行可能就不会被分开，在寄生虫移行期间，宿主组织降解物能提供给寄生虫用以更进一步消化和吸收的物质。半胱氨酸蛋白酶主要的生化性质还是其蛋白水解作用。正是因为这个性质，使得该酶成为某些寄生虫的主要“消化酶”。有人通过捻转血矛线虫的体外培养试验，表明了该虫体分泌的半胱氨酸蛋白酶可抑制绵羊红细胞的凝集，水解血红蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和IgG，而半胱氨酸蛋白酶对IgG的水解主要是作用于绞链区使其降解［16］。从卫氏并殖吸虫囊蚴纯化出的酸性半胱氨酸蛋白酶能降解人血清白蛋白、免疫球蛋白、补体成分等多种人体蛋白质［17］。在曼氏血吸虫中，在盲肠内壁的肠表皮细胞中发现了一种组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶，此酶可能涉及白蛋白和血红蛋白的降解，以此作为血吸虫童虫的主要营养来源［4，18］。而有棘颚口线虫组织蛋白酶 L1（Gnathostomaspinigerumcathepsin L1，GsCL1）在肠中的定位，说明了此蛋白酶对有棘颚口线虫三期幼虫（L3）摄入的宿主蛋白有降解作用［19］。

半胱氨酸蛋白酶在寄生虫侵入宿主的过程中也起着重要的作用。通过捻转血矛线虫对结缔组织降解能力的研究，发现该虫分泌的半胱氨酸蛋白酶能够降解结缔组织的主要成分，而对宿主结缔组织的降解有利于对宿主组织的破坏和易于虫体的侵入［20］。肝片吸虫组织蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶2（Fasciolahepaticacathepsin L cysteine proteinases，FhCL－2）以产生一种纤维蛋白凝块的方式切割纤维蛋白原［21］。Berasain P等［22］证明了 FhCL－1和FhCL－2能降解细胞外基质和基底膜分子以促进寄生虫自身移行。

4 其他方面

4.1 半胱氨酸蛋白酶对寄生虫生殖力的影响

一种组织蛋白酶被免疫定位于肝片吸虫成虫的梅氏腺中［23］。梅氏腺是一簇细胞，它们能够分泌催化虫卵卵壳的形成。用4.8mg的E／S产物（含1300μg半胱氨酸蛋白酶）免疫水牛后，证明了在粪便中的大片吸虫虫卵数明显下降［10］。因此，推测接种后的水牛体内，梅氏腺半胱氨酸蛋白酶L是免疫反应的目标，它可导致卵壳合成受到干扰。对吸虫自身生殖的影响，可依次对从终末宿主到中间宿主的传播各环节施加影响。

4.2 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫脱包囊、脱鞘和羽化中的作用

原虫、蠕虫和节肢动物的羽化，包囊破裂，甚至包囊形成都需要半胱氨酸蛋白酶的参与。在卫氏并殖吸虫中，半胱氨酸蛋白酶涉及宿主肠腔内囊蚴的脱囊。L3期美洲板口线虫脱鞘和曼氏血吸虫虫卵孵化都需要半胱氨酸蛋白酶，盘尾丝虫、犬恶丝虫和彭亨丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂阻滞L3幼虫期蜕皮。研究发现，恶性疟原虫滋养体（或裂殖体）的可溶性胞体提取物中的半胱氨酸蛋白酶能够从人红细胞膜锚蛋白的C端裂解掉一个155ku肽段，而锚蛋白是红细胞膜的结构蛋白，高亲和性连接于红细胞定形素—肌动蛋白，形成膜骨架网络结构。降解后的锚蛋白与细胞膜的连接减弱，从而降低了红细胞膜骨架的稳定性，使其脆性增加，有利于虫体的人侵和释放。此前也有人从伯氏疟原虫裂殖体和裂殖子的顶端复合体中鉴定出了68ku的半胧氨酸蛋白酶，该酶可能在虫体的人侵中具有一定作用。

这些情况说明了半胱氨酸蛋白酶在寄生虫的发育过程中是有重要的作用。

4.3 半胱氨酸蛋白酶的免疫原性

半胱氨酸蛋白酶在不同的虫种和同一虫种不同期，其化学结构、分子质量和性质都不尽相同，其免疫原性也存在着种特异性和期特异性。从肝片吸虫成虫排泄分泌物中纯化出两种半胱氨酸蛋白酶（Fasl和Fas2），经试验分析显示它们是免疫优势抗原，可被肝片吸虫病患者血清识别，敏感性和特异性均较高［20］。曼氏迭宫绦虫裂头蚴分泌的半胱氨酸蛋白酶（分子质量分别为21，27和53ku）能够引起宿主特异性IgE抗体反应。由此可见，寄生虫半胱氨酸蛋白酶具有较强的免疫原性。利用此免疫原性，可将半胱氨酸蛋白酶用于寄生虫病的免疫诊断和疫苗的研制［24，25］。

5 展望

目前随着对半胱氨酸蛋白酶的发现以及其结构和功能研究的深入，寄生虫的半胱氨酸蛋白酶也受到越来越多的学者关注。对它的研究不仅揭开了寄生虫与宿主相互作用的机制，也给寄生虫病的诊断与防治开辟了新的思路，给目前化学治疗所引起的越来越严重的耐药性问题的解决带来了希望。如将半胱氨酸蛋白酶作为治疗寄生虫化学治疗的新靶点，利用相应的特异性抑制物来抑制寄生虫半胱氨酸蛋白酶的活性，阻断寄生虫的营养、免疫逃避、侵入及对宿主的损害作用，从而达到治疗寄生虫病的目的，在这个领域已经开展了许多相关的研究。相信今后半胱氨酸蛋白酶将会得到更加广泛的研究和应用。

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