卵巢移植技术及其应用研究进展＊

彭南妮，袁安文，邹红艳，吴方贵，许学岚，薛立群

（1.湖南农业大学动物医学院与动物科技学院，湖南长沙 410128；2.广东省深圳市第五人民医院生殖中心，广东深圳 518001）

卵巢是动物和人类雌性个体的重要生殖器官，具有产生卵子和分泌性激素等主要功能。卵巢功能的严重损害将导致雌性丧失繁殖后代的能力。随着动物及人类辅助生殖技术的发展，特别是卵巢冷冻保存、卵母细胞体外成熟与受精等技术的完善，卵巢移植技术与之相结合，已取得突破性进展，正在成为保存和延续雌性个体生殖能力的一项重要技术。

卵巢移植技术的研究早在19世纪60年代初就已开始，1896年Knauer首次在动物中成功地进行了自体卵巢移植。1906年Carrel等采用血管吻合方法进行卵巢移植，使移植卵巢存活并成功创立了器官移植血管吻合技术。随后人们相继在大鼠、小鼠、兔、羊、猪、猕猴和人等成功进行了卵巢移植，开创了卵巢自体原位移植，自体异位移植，同种异体移植和异种移植等技术，在生殖医学领域和濒危动物种质资源的抢救及保护方面显示出良好的应用前景。

1 卵巢移植技术

1.1 自体原位移植

卵巢自体原位移植（orthotopic autograft）是将摘除后保存的卵巢或卵巢组织自体移植到卵巢正常解剖部位的一种方法，主要用于防止因严重疾病或肿瘤治疗对卵巢或卵巢功能的损伤，在尚未累及卵巢之前，将卵巢摘除和冷冻保存，病愈后进行原位移植，避免癌症女性患者因放疗和化疗而丧失生育能力和性激素分泌功能，使其仍可恢复自然妊娠生育，重新获得自身的生育能力。

目前卵巢自体原位移植主要采用非血管吻合的方式，通过腹腔手术或腹腔镜手术将冻融卵巢皮质组织块植入卵巢囊或卵巢系膜内。卵巢移植体在移植部位建立血供后可恢复卵泡发育与性激素分泌功能，且因靠近输卵管伞部也有利于排出卵子的捡拾，移植受体可望恢复自然生育能力，实现自然妊娠，或结合体外受精辅助生殖技术繁育后代。Gosden R G等［1］将冻融的绵羊卵巢组织进行自体原位移植，成功分娩羊羔。Donnez J等［2］报道一位自体原位移植冻融卵巢组织的妇女3个月后卵巢组织开始恢复其功能，出现卵泡发育、血清雌激素含量升高，患者再现卵巢周期，实现了自然妊娠并产下健康婴儿。多个临床应用研究在体外受精技术的辅助下，利用自体原位移植卵巢组织腔卵泡的卵母细胞，也成功产下健康婴儿［3－4］。此外，一位自体原位移植冻融卵巢组织的妇女，在第一次通过体外受精实现妊娠并产下女婴后，再次实现自然妊娠，产出健康婴儿［5］。这些临床应用研究结果表明，卵巢自体原位移植可成为救助女性生殖能力的有效方法，使患者恢复自然生育能力。但是，因移植手术引起的输卵管阻塞、手术后组织粘连等因素可影响受体的自然妊娠。

1.2 自体异位移植

卵巢自体异位移植（heterotopic autograft）是将卵巢或卵巢组织移植到自体其他部位。移植部位通常选择在皮下、肾囊下、肌肉、腹膜和网膜等。与原位移植相比，选择皮下和肌肉等浅表部位进行卵巢移植，具有移植手术相对简单且容易对移植体进行监测等优点，但需要辅助体外受精技术实现妊娠生育。在临床研究中，人们对自体异位移植卵巢或卵巢组织的功能恢复情况进行了观察和检验。早期人们采用显微血管吻合方法将卵巢移植入患者前臂皮下，1年后从移植卵巢中采集到成熟卵子，患者恢复并维持规律性卵巢周期超过1年时间。同样，采用简便的非血管吻合方法将卵巢皮质组织自体植入病人的的前臂皮下，10周后卵巢移植体有卵泡发育，连续18个月有优势卵泡形成，并产生成熟卵母细胞。Laufer M R等［6］对患癌症的小女孩进行了卵巢自体异位移植效果追踪调查，确认移植卵巢维持长达12年～15年的性激素分泌。同样，Igarashi S等［7］选择在腹膜和网膜部位对短尾猴卵巢皮质组织进行自体移植，也实现了卵巢功能的恢复，经超数排卵和显微注射受精处理获得成熟卵子和囊胚。Oktay K等［8］将患者冷冻保存的卵巢组织移入自体腹部皮下，3个月后移植卵巢组织恢复卵泡发育并产生雌激素，经卵子体外受精后获得早期胚胎，并在后期的临床研究中实现妊娠生育，产下健康婴儿［9］。然而，与自体原位移植相比较，自体异位移植的效果似乎更多受局部环境的影响［10］。

1.3 同种异体移植

同种异体移植（allograft）包括同种异基因移植（allograft）和同种同基因移植（syngraft），前者是指同一动物种属内遗传背景不同个体间的移植；后者是指遗传背景完全相同个体间（同卵孪生子或近交系动物）的移植。同种异体移植使得移植受体可以利用同种群体的卵巢资源实现妊娠与生育，对满足特定个体生育要求以及挽救濒危动物物种具有特殊意义。在卵巢同种异体移植中，同基因移植通常不引发排斥反应，可在单合子双生姐妹间进行。Donnez J等［11］对发生卵巢早衰的特纳综合征（Turner syndrome）患者进行了卵巢移植，在植入单合子双生姐妹供体卵巢皮质组织后3个月，卵巢移植体恢复功能，并在出现规则卵巢周期7个月后受体患者自然妊娠并生育一健康女婴。Silber S J等［12］报道，进行了新鲜或冻融卵巢组织移植的10对单合子双生姐妹，移植受体全部恢复了卵巢周期和排卵，其中6例自然受孕，并产下2个健康婴儿。临床研究中异基因移植一般需要考虑移植受体对供体卵巢移植物的排斥反应。有报道认为，卵巢并非免疫特惠器官，卵巢异体移植需要配合长期免疫抑制剂处理［13］。Pullium J K等［14］对6只白细胞抗原相同的一窝青年母犬进行了卵巢异体移植并使用免疫抑制剂，术后这些母犬经历了初次发情，出现每年两次的正常发情周期和相应的孕酮水平升高，配种后有母犬受孕。Donnez J等［15］发现，在白细胞抗原（HLA）配型完全相同的非单合子双生姐妹间进行过骨髓移植的受体，形成完全供体嵌合体，再次接受同一供体的卵巢移植时，即使在不使用免疫抑制剂的情况下也不发生排斥反应，卵巢可在移植3.5个月后恢复卵巢周期活动和雌激素分泌。

在不同部位进行卵巢同种异体移植的效果比较中，Soleimani R等［16］利用小鼠模型确认，选择背部肌肉部位移植要优于肾囊下移植，可以获得更多的新生血管支持，有较多原始卵泡存活。

1.4 异种移植

卵巢异种移植（xenotransplantation）指不同种属个体间的卵巢移植，可以通过冷冻卵巢组织异种移植获得成熟卵母细胞，产生体外受精的新生个体，对保护和利用濒危物种的卵巢组织具有特殊意义。研究表明，异种移植卵巢或卵巢组织可在异种雌性甚至雄性动物体内生长发育，卵巢原始卵泡不仅可以发育到有腔卵泡，而且还可获得生长发育卵母细胞，实现体外成熟、体外受精和胚胎发育，代替体外长期培养体系［17］。

由于受种间组织的免疫排斥反应的限制，卵巢异种移植主要选用免疫缺陷动物作为移植受体，如裸鼠、重症联合免疫缺陷鼠、非肥胖糖尿病－重症联合免疫缺陷鼠（NOD－SCID）等。Weissman A 等［18］将人卵巢组织植入NOD－SCID鼠皮下，2周后在74%的卵巢移植体中观察到卵泡，12周后51%的卵巢移植体在外源促性腺激素的刺激下出现卵泡生长和腔卵泡。Moniruzzaman M等［19］对植入SCID鼠的仔猪冻融卵巢组织进行了观察，发现卵巢原始卵泡在移植2个月后可发育至次级卵泡并伴有卵子的生长发育。Kaneko H等［20］将仔猪卵巢组织植入免疫缺陷鼠肾囊下，并在阴道分泌物中发现有角质上皮细胞后按3个组分别用5单位eCG处理10、30、60d，结果显示，移植45d～70d后各试验组的受体鼠都开始发生阴道上皮角质化并有少量腔卵泡发育，但仅从60deCG处理组小鼠获得大量体积完全增大的卵母细胞，且抑制素总水平在各组中最高；其中17%的卵母细胞经体外成熟培养发育成熟，释放出第一极体。Snow M等［21］将小鼠卵巢异种移入裸体雌性大鼠肾囊下，21d后采集到生发泡时期卵母细胞和扩展的颗粒细胞－卵母细胞复合体，经体外成熟培养和受精后进行2细胞胚胎移植，成功产下健康仔鼠。

卵巢异种移植可选用不同部位进行，常见的移植部位包括腹膜内、卵巢囊、肾囊下、肌肉内和 皮下。由于不同研究结果的差异，目前对最适宜的移植部位尚缺乏同一的认识。Dath C等［22］应用免疫组化方法对植入4个不同部位（腹膜内、卵巢囊、皮下和肌肉）的冻融卵巢组织进行了观察，发现植入后3周肌肉部位的卵巢组织发生间质纤维化的程度低于其他部位。一般认为，移植后卵巢组织的存活及其功能恢复状况与卵巢组织的血管新生及血液再灌注有关，受移植部位生理环境影响。Eyck等在对植入裸鼠腹膜内冻融卵巢组织的观察中发现，移植后3d卵巢组织块的周边出现受体鼠的新生血管和血液灌注，10d时血液灌注和血管化过程明显增强，卵巢组织块在中心部位出现明显的血管再形成和血液灌注［23］。Soleimani R等［24］对人冻融卵巢组织植入SCID鼠背部肌肉和肾囊下的效果进行了比较，发现植入背部肌肉的卵巢组织在血管发生和腔卵泡的发育方面更为突出，并能够从更多的发育卵泡中获得第二次减数分裂中期的成熟卵子。移植体的血管化作用与卵泡大小相关，FSH可刺激微血管和大的腔卵泡的形成，并从生长卵泡中获得第二次减数分裂中期的成熟卵子。

2 卵巢移植技术的应用前景

2.1 在人类生殖医学的应用

在人类医学中，由于遗传、感染、自身免疫性疾病及医源性因素等造成的卵巢功能早衰，放疗及大剂量全身化疗对女性癌症患者卵巢功能的损害，使得患者甚至青年女性和儿童承受丧失生育能力的风险，保存卵巢功能和生育能力成为许多患者的愿望。随着卵巢移植技术的发展以及与辅助生殖技术的结合，卵巢自体原位和异位移植、卵巢异体移植已在临床中应用，以挽救卵巢功能早衰和癌症患者的卵巢功能和生育能力。直至目前，临床中应用新鲜或冻存卵巢及卵巢组织移植，已使多位患者实现生育，成功产下健康婴儿，其中一位患者先后二次受孕和分娩。这些成功例证充分显示了卵巢移植技术在生殖医学领域中的应用价值和潜力。

2.2 稀有及濒危哺乳动物卵巢资源的保护与利用

卵巢移植技术在稀有及濒危动物的保护和卵巢生殖细胞资源的利用中具有重要应用价值。大多数动物在出生前后，有大量原始卵泡在卵巢组织中形成和储备，进入成年繁殖期后仅有一小部分被利用。因此，从不同年龄阶段甚至新近死亡的雌性个体获得的卵巢组织，可以通过冷冻保存技术和移植技术得到充分利用。卵巢组织移植后，可从发育的生长卵泡中获取成熟卵母细胞，经体外成熟培养、体外受精（IVF）或胞质内精子注射（ICSI）生产胚胎，繁育后代。相关的技术研究已逐步由小型实验动物（小鼠、大鼠、兔等）和家畜（猪、牛、羊等）扩展至多种驯养动物（狨、猕猴、短尾猴、大象、袋熊和小袋鼠等）。卵巢组织异体移植技术和异种移植技术的发展和完善，将为稀有及濒危哺乳动物的保护和利用提供新的方法和手段。

此外，卵巢移植技术还可用于一些生育力低、不育、绝育的转基因实验动物的繁殖。由于这类实验动物自身生殖力低，可通过卵巢移植技术，利用具有正常繁殖力的相同品系个体为移植受体实现快速繁殖后代，扩大转基因动物群体。在转基因小鼠的繁殖中这一技术已得到成功应用，已经有C57BL／6小鼠、绿色荧光蛋白转基因小鼠等通过新鲜或冻存卵巢异体原位移植后成功产仔［25］。刘英等［26］将PCR阳性SV40T转基因雌鼠卵巢移植到FVB雌鼠卵巢囊内，也成功繁殖后代，后代转基因阳性率达到25.4%。基因敲除的杂合子小鼠卵巢经玻璃化冷冻保存后异体原位移植亦成功获得其后代。

2.3 用于建立卵巢卵泡发育研究模型

卵巢移植技术作为建立动物模型的新方法已应用于卵泡发育的研究。利用卵巢移植动物模型，人们可以容易观察和检测卵巢组织的功能活动，研究不同阶段卵泡发育的调控机制，评价不同方法对卵巢冷冻保存的效果等。在实践中人们可以根据研究需要选择雌性受体动物进行自体异位移植、异体移植或异种移植，也可采用雄性受体动物进行卵巢移植。相关研究结果显示，在雄性受体鼠中胎鼠和新生鼠卵巢具有与雌性受体中相似的生长发育能力，雄性个体可以提供卵巢及卵泡生长发育所需的基本生理环境［27］。

研究表明，移植卵巢组织在完成血液循环重建之前，经历了组织缺血过程，使得移植卵巢中的生长卵泡退化，仅能维持原始卵泡生存。基于这一特点人们可以利用卵巢移植动物模型研究原始卵泡募集过程的生理调节机理，并验证了FSH对早期卵泡发育的调节作用。建立这样的动物模型，可能对进一步研究调控早期卵泡发育的局部因子和其他内分泌因素，确定发育关键点，设计出符合早期卵泡和卵母细胞发育生理要求的培养体系都具有积极意义。

刘利兵等［28］利用家免角膜板层内植入自体卵巢的方法，建立了角膜培养卵巢皮质组织的动物模型。该研究报道，卵巢组织可在眼角膜内成活，使用雌激素后能够直接观察到卵巢组织的外观形态变化，可作为一种较好的研究模型用于评价药物对卵巢组织的作用效应。此外，冻融卵巢组织的移植，也被普遍用于卵巢组织冷冻保存方法的评价，检验卵巢组织冷冻保存后的卵泡生长发育能力。

3 影响卵巢移植效果的主要因素

3.1 缺血对移植卵巢的损伤

缺血对移植卵巢的损伤主要发生在非血管吻合方式的卵巢移植。移植卵巢在血管再生之前的缺血期里，易受到活性氧分子攻击，产生缺血再灌注损伤（ischaemia－reperfusion injury），引起卵巢细胞凋亡，甚至卵巢组织发生坏死。移植后缺血使得移植卵巢中生长卵泡很少有存活，存活的主要是原始卵泡。如何使卵巢组织的血管快速重建，尽可能地缩短缺血时间是移植后卵巢组织存活的关键。

目前减少缺血损伤的方法主要有：①使用抗氧化剂如维生素E、β－巯基乙醇或枸杞多糖等，减少过氧化物等活性氧分子的攻击，减少卵泡的损失；②将卵巢组织移植到肉芽组织，加快移植体血管再生，提高卵泡存活率；③使用血管内皮生长因子及转化生长因子（TGF）等提高血管再生速度；④使用外源性促性腺激素刺激血管生长因子，如VEGF、TGF等的合成，诱导和促进新血管的形成，减轻局部缺血缺氧的发生。但这些方法不能完全解决卵巢移植技术中的缺血损害问题，要进一步提高移植卵巢存活率，有效保存移植卵巢生殖内分泌机能，还需更多地研究解决这一问题的方法，减少缺血对移植卵巢的损伤。

3.2 免疫排斥反应的影响

异体卵巢移植后引起的免疫排斥反应有急性排斥反应和慢性排斥反应两种。急性排斥反应与主要组织相容性复合物（MHC）有关，常使卵巢移植体难以存活。慢性排斥反应一般发生在移植后一年左右，主要表现为卵巢移植体功能减退，卵巢间质和血管发生纤维化，最终导致卵巢移植体功能丧失。有人用免疫抑制剂环孢素A（CsA）抑制免疫排斥反应，认为能改善移植卵巢的存活率，还能促进移植后卵巢的功能恢复。一般认为肾是相对免疫缺陷区，选择肾囊下进行卵巢组织移植，可减轻免疫排斥反应的发生。一些研究表明，移植前进行卵巢移植物的组织培养，能降低移植物的免疫原性，使移植后的免疫排斥反应减轻，更有利于提高移植物的临床移植效果。移植前进行组织抗原配型通常可以减低免疫排斥反应，有益于移植卵巢的存活和功能的恢复。免疫排斥反应是影响异体移植成功的一个主要因素，如何降低其影响，维持移植卵巢长期存活并具有功能，还有待进一步研究。

3.3 冷冻保存对移植卵巢的损伤

卵巢组织冷冻保存技术已取得显著进展，但冷冻方法仍对卵巢组织有一定损伤［29－30］。与新鲜卵巢移植相比，冷冻卵巢移植体的卵泡发育数量一般少于新鲜卵巢移植体。这可能与降温冷冻过程中细胞内冰晶形成和盐类的沉积对细胞造成的损伤有关。为减少冻融过程对卵巢组织的损伤，仍有待于选择理想的冷冻保护剂和改进冷冻保存方法。随着冷冻生物技术的不断发展和完善，卵巢冷冻保存效率也必将不断提高，卵巢移植技术也将更具有实际应用价值。

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