转基因动物及其食品安全评价技术研究进展＊

宋社果，安小鹏，杨明明，曹斌云

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨陵 712100；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨陵 712100）

转基因动物食品（transgenic animal food）是指利用分子生物学手段，将备选生物的外源基因转移到特定受体动物体内，使其出现与原品种不同的性状或产物。将以转基因动物及其产品为原料加工生产的食品称为转基因动物食品。通过这种技术可获得更符合人们要求的食品，具有产量高、营养丰富、保健作用强等优势，但必须对其可能造成的遗传基因污染等安全性进行可靠的评价才能推广应用［1］。

1 国内外转基因动物及其食品安全评价的发展趋势

1.1 我国非常重视转基因动物及其食品安全评价问题

我国非常重视转基因动物及其食品的研究，其理由是由于转基因技术与传统育种技术的本质都是通过获得优良基因进行遗传改良，而两者不同的是，传统常规杂交育种是将整条的基因组（染色体）转移，而转基因育种是选取基因组中最有用的一小段特定基因进行转移。可见，转基因比常规杂交具有更高的选择性和目的性。因此，将转基因技术与传统育种技术紧密结合，能培育出多抗、优质、高产、高效新品种，大大提高动物品种的改良效率，并可降低粮食消耗，在保障食品安全、保护生态环境、拓展动物农业功能等方面潜力巨大［2］。

目前，我国在转基因动物育种及其食品开发利用方面出现了两个不容忽视的问题，一方面是国家高度重视转基因动植物育种工作，投入巨资开展研究，成绩斐然；另一方面是部分科技工作者及其广大民众对转基因动植物的安全性质疑声日益高涨，其影响程度已远远超过技术体系本身范畴。可见，很好地解决这些问题的关键是要设计出让广大消费者放心的转基因动物安全评价技术体系。近几年来，我国在转基因动物研究方面进展很快，先后有牛、羊、猪、鱼等转基因动物产生，其中有多种转基因动物相继进入环境释放，乃至安全证书认证阶段。尽管我国政府及其主管部门对于转基因动物的安全评价极其慎重，国务院于2001年5月23日颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，并在农业部专门建立了国家转基因动物评价安全委员会，制定了相关评价标准和框架体系，每年定期精心组织开展对申报的转基因动物及其产品进行安全评价，对于我国转基因动物的安全起到了非常重要的作用，也为进一步完善我国转基因动物安全评价体系积累了丰富的经验，并奠定了相当坚实的基础。但由于我国转基因动物安全评价体系的建立仍然处于初创阶段，不可避免的存在着重国外引进，轻自主研究；重定性判断，轻定量裁定；重主观标准，轻客观测量；重宏观体系，轻微观细则；重标准制定，轻操作要求；重单一技术，轻配套技术；重体系构建，轻标准衔接；重书面审查，轻现场查验等问题。以上这些问题的存在，尽管是发展中逐步完善的课题，但在我国将动植物种业提高到国家战略层面，高度重视转基因动物安全的前提下，尤其是在广大民众普遍关切我国转基因动物安全的大背景下，迫切需求加快转基因动物安全评价体系的研究，尽快为国家、为民族、为广大城乡消费者研制出具有中国特色，党和国家及广大人民群众十分放心的转基因动物安全评价体系，为我国转基因动物的安全、健康的可持续发展保驾护航，为广大城乡消费者放心消费转基因动物产品提供安全的技术壁垒和屏障［3］。

1.2 转基因动物及其食品的潜在危害性

随着转基因技术的发展，人们对转基因技术的弊端也有了更为深刻的认识，对转基因生物安全性争论主要集中在以下几个方面：

1.2.1 转基因动物通过食物链对人类产生直接影响 由于转基因动物的分子和生化机制改变，通过食物链可能对人健康造成的危害总结为4点：一是转基因动物中的毒素可引起急、慢性中毒或产生致癌、致畸、致突变作用；二是动物中免疫或致敏物质可使人类机体产生变态或过敏反应；三是基因产品中的主要营养成分、微量营养成分及抗营养因子的变化，会降低食品的营养价值，使其营养结构失衡；四是人们在食用转抗性基因的食物后，食物会在人体内将抗药性基因传给致病的细菌，使人体细菌产生抗药性［4－5］。

1.2.2 通过生态链对环境产生影响 转基因产品可能对环境质量、生态系统或生态平衡产生不利影响。转基因生物可能在自然界中释放，将污染自然基因库，打破原有的生态平衡，对生态环境产生难以预料的冲击。转基因动物通过与野生物种杂交，会出现野生物种疯长并难以控制。有些转基因动物进入自然环境或生态系统后，通过动物杂交，会将转基因特性传给其他动物，使其他动物产生病虫害，严重的会因此搅乱原有的生态平衡、生态秩序。

1.2.3 转基因产品有助于制造生物武器 生物武器可能对人类带来毁灭性的危险，克隆技术、遗传工程等也冲击人类传统道德、破坏人类秩序。转基因产品与伦理道德等问题也引起世界各国的广泛重视。

1.3 不同国家对转基因动物及其食品的评价态度

对于转基因动物及其产品的潜在性风险，各国政府的出发点都是在保证人类健康、农业生产和环境安全的基础上，促进其发展。但由于各国农业资源情况、文化背景、转基因技术水平，民众风险意识、政府态度不同而对转基因动物及其产品态度不一。美国政府认为转基因产品非常安全，因为该产品是生物技术创新和发展的应用，从本质上说是经过生物科技加速的自然选择过程，动物基因工程与目前的动物培育技术并无巨大差异。欧盟则认为转基因产品对人类健康和生态环境可能造成一定的危害并大力宣传转基因作物的风险甚至称其为“魔鬼食品”或“自杀食品”，这大大影响了欧洲消费者对转基因产品的看法［3］。日本政府对转基因产品的态度既不像美国那样宽松，也不像欧盟那样谨慎。党中央、国务院高度重视转基因技术研究与应用。2006年，将转基因生物新品种培育重大专项列入《国家中长期科学和技术发展规划纲要》（2006－2020年）。2008年7月，国务院批准启动了转基因生物新品种培育重大专项。2009年6月，国务院发布《促进生物产业加快发展的若干政策》，提出“加快把生物产业培育成为高技术领域的支柱产业和国家的战略性新兴产业”。2010年中央1号文件提出，“继续实施转基因生物新品种培育科技重大专项，抓紧开发具有重要应用价值和自主知识产权的功能基因和生物新品种，在科学评估、依法管理基础上，推进转基因新品种产业化。”尽管我国相继颁发了《新食品资源卫生管理办法》、《基因工程安全管理办法》、《农业生物工程安全管理实施办法》、《动植物转基因安全条例》等一系列法规文件，但是与发达国家相比，我国转基因生物及其产品安全管理工作处于初创阶段，转基因动物及其产品安全评价技术体系仍需进一步完善。

转基因生物不确定的危害性威胁着全人类生活环境和人类健康，并且由转基因生物引起的国际争端也愈演愈烈。一方面，如果放任转基因生物越境转移，一国转基因生物造成的生态环境和人类健康问题将迅速全球化；另一方面，如果放任各国对转基因生物采取不同的限制措施，扼杀对促进农业发展和人类进步颇具前途的基因技术，甚至阻碍非转基因产品的正常贸易。在这种情况下，来自130多个国家的代表在经过长达5年的谈判之后，《生物安全议定书》于2000年1月28日获得通过。议定书规定，对于转基因生物实行风险预防原则（precautionary principle），即对于新生事物，当还不能确定它的出现将会产生怎样的后果时，一定要以非常谨慎的态度来对待它。应当首先认真考察它的安全性，只有在完全确认了它是安全的之后，才能够让其得到进一步的发展。

目前，食品价格上涨和全球食品短缺为各国政府、食品企业以及消费者带来新的压力，促使人们重新审视对转基因技术的态度，至是在最反对转基因食品的欧洲，一些主要的政府官员和商业领袖也开始呼吁批准进口转基因作物。因此，对转基因生物及其产品的安全性进行合理评价尤为重要。

1.4 国内外转基因动物的安全评价标准的研究趋势

转基因动物及其产品的研发对于构建人类疾病模型、基因治疗、生产转基因药物、提高动物产量和动物产品品质等不可或缺。虽然其潜在的风险尚未显现，但从人类自身健康和社会生态环境安全方面出发，除了对转基因动物及其产品的研究和利用采取严格的安全审查和管理制度外，对其安全检测与评价也显得尤为重要。但目前为止，与转基因植物相比，我国和世界上对转基因生物及其产品安全的数据和市场监管经验都相对较少［1］，对转基因动物及其产品的安全性能评价体系也相对不完善。2001年，加拿大政府一份临时性报告认为，尽管对转基因动物的安全性评估仍需要指定详尽的规划，但对转基因植物的评估原则可以用来转基因动物的评估［3，6］。综上所述，建立可靠、高效的转基因动物及其食品的安全评价体系，有助于在针对我国现有国情条件下及时有效地对转基因动物及其产品风险进行正确评估，在转基因动物及其产品在促进人类社会和谐健康发展，快速提高人民生活质量，降低生活成本的基础上得到健康快速的可持续发展。

2 转基因动物及其食品安全评价技术的研究进展

目前，发达国家对于转基因动物产品安全性的评估主要集中在有实质等同性，是否具有应变原性，是否会发生基因转移，是否具有毒性，是否会引起外源激素摄入，是否会产生破坏性基因或者导致破坏性基因的蔓延、对生态环境的破坏性，完善后期市场的监控等方面。我国借鉴发达国家的经验，也对转基因动物安全性评价做出了相应的规定，包括受体动物的安全性评价，基因操作的安全性评价，转基因动物的安全性评价和转基因动物产品的安全性评价4个方面。纵观世界各国对于转基因动物安全评价的研究重点及趋势，结合我们直接从事转基因动物安全评价的实践，我们认为对转基因动物的体内安全性评估应当包括以下几个方面。

2.1 转移的外源基因本身安全性评价的技术

转移的外源基因本身安全性评价的关键技术外源基因分为三类，即辅助转化的基因（如报告基因、抗生素抗性筛选基因），改良性状的目的基因（如抗病、品质性状改良）和调控目的基因表达的序列（如启动子、终止子和增强子序列）。转基因生物所含外源基因的释放必须经过严格的审批，因此对外源基因的鉴定及其安全性评价是转基因动物安全性评估的一个重要方面。

DNA测序技术结合生物信息学的预测技术是被国内外研究者证明可广泛的应用于核酸鉴定、分类及功能预测的重要成熟技术和方法。通过序列测序结果与各生物信息中心数据库中已经发布的序列比对，根据与其相似度高的序列的序列信息验证外源基因的功能和特性，并结合相关研究报道进行已转入基因的安全性评价。

2.2 外源基因插入位点核定的关键技术

将外源基因导入受体动物细胞时，因外源基因插入动物基因组的形式、位置和拷贝数具有差别，所以得到的转基因动物并不相同，同一转化过程往往能获得多个独立的转基因动物类型。因此，对不同转基动物进行筛选评价，确定其插入位点是国内外评价转基因动物体内安全的重要方面［7］。

2.2.1 反向PCR技术 通过对外源基因插入位点两侧序列进行克隆分析是确定外源基因插入位点的一个重要方法，其中反向PCR技术（Inverse PCR，IPCR）是最早提出的基于PCR的染色体步移技术之一，操作简单，且可同时获得已知序列两侧的未知序列并已成功用于转座子整合位点的分析、启动子的克隆等。此种方法具有较高的灵敏度，因此容易导致假阳性和假阴性结果［8］。

2.2.2 荧光原位杂交技术 可通过荧光杂交信号对外源DNA序列在染色体或DNA纤维上进行定位、定性、相对定量分析。与反向PCR技术相比，荧光原位 杂 交 技 术 （fluorescent in situ hybridazation，FISH）具有安全性高，周期短，信号强，较低的假阳性假阴性等优点，目前已经成功用于马铃薯进行重复序列的定位和抗虫基因准确的染色体定位等。基于前人研究成果，应用FISH技术可对外源基因在转基因动物体内进行定位、定性和相对定量分析具有很大可行性［9］。

2.2.3 锌 指 核 酸 酶 技 术 （zinc finger nuclease，ZFN）技术 该技术是近年来发展起来的一种对基因组DNA实现靶向修饰的新技术。它通过作用于基因组DNA上特异的靶位点产生DNA双链切口（double strand break，DSB），然后经过非同源末端连接（non－homologous end joining，NHEJ）或同源重组（homologous recombination，HR）途径实现对基因组DNA的靶向敲除或者替换，无物种特异性。采用锌指核酸酶技术针对插入序列两侧序列设计两个或多个锌指核酸酶，实现外源基因的定点删除，对检测出的插入位点进行验证。目前该技术已经被广泛应用于基因靶向修饰的研究［10］。

2.2.4 外源插入基因对上下游基因影响测定的技术

基因表达系列分析 （serial analysis of gene expression，SAGE）可以高通量且快捷有效的研究基因表达，研究由细胞转录变化引起的生物现象，而无须对基因性质和生物系统预先有所了解。它不但能快速、详细地同时检测成千上万个基因转录本的丰富信息，并且能对这些转录本的表达拷贝数进行定量分析，还发现潜在的未知基因［11］。此项技术可用于检测转基因山羊体内由于外源基因的导入对上下游基因表达的影响。规模化蛋白质表达谱研究的主要任务和目标就是研究一个完整的生物体（个体、组织或细胞）所表达的全套蛋白质随时间和空间的变化，包括蛋白质的表达丰度、表达差异、与基因组和转录组的关系等，应用此项技术可在蛋白质水平上获得对转基因山羊体内基因表达变化的全面认识［12］。目前，研究蛋白质表达谱的技术路线主要有两条，一条是传统的基于凝胶电泳的（gel－based）蛋白质鉴定技术，如双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2－DE）结合质谱技术，在比较蛋白质组学研究中广泛被运用；另一条是基于非胶体系的多维液相层析分离与生物质谱相结合的技术路线（MudPIT），数据产出通量高、速度快和Top－Down策略，鉴定蛋白质的序列覆盖率高，可以分析蛋白质的翻译后修饰位点。由于动物结构的复杂性，该项技术主要运用于某个器官或者组织中的蛋白质组，并被成功用于小鼠脑蛋白质组、小鼠上皮神经组织的蛋白质表达谱、人乳腺上皮细胞蛋白质等［13－14］。

2.2.5 转基因动物的遗传稳定性检测技术 转基因动物的遗传稳定性指纹图谱检测技术是指能够鉴别生物个体之间差异的电泳图谱，可靠方便、准确快速、不受环境影响，反映了个体间的内在差异，适合于亲子代之间遗传差异性的鉴定工作，可以用于转基因动物体内遗传稳定性的检测。目前在品种鉴定中应用较多的指纹图谱主要有两种，一种是较早开始研究的生化指纹图谱，包括同工酶电泳指纹图谱和蛋白电泳指纹图谱；另一种是20世纪90年代之后发展起来的DNA指纹图谱。目前用于生物品种鉴定的主要有4种，即RFLP、RAPD、SSR和 AFLP。该4项技术操作体系成熟，简单方便，有很强的可操作性。

2.2.6 转基因动物免疫性检测技术 转基因动物免疫性检测技术是指利用免疫反应特异性的原理，建立各种检测与分析的技术。常规免疫检测技术主要是用于检测抗原或抗体的体外免疫血清学反应或免疫血清学技术。免疫血清学技术是建立在抗原抗体特异性反应基础上的检测技术。现代免疫检测技术的发展非常快，已有许多新的方法和技术出现。在基因的分离、克隆的筛选，表达产物的定性与定量分析，表达产物的纯化等均涉及到免疫技术。如通常用免疫沉淀方法分离mRNA基因，酶标抗体核酸探针（地高辛核酸探针）检测筛选克隆，免疫转印技术分析表达产物的分子量、ELISA或RIA分析表达量、免疫亲和层析纯化表达产物，免疫方法分析表达产物的性质如免疫原性。免疫检测技术已是评价转基因安全性研究中必不可少的方法［15－16］。

2.2.7 转基因动物生物学特性检测技术 张甫英等人对采食转"全鱼"基因黄河鲤的小鼠的生理和病理研究证明，对照组小鼠和试验组小鼠其生长、血液常规、血液生化、组织病理等方面没有显著差异，从而得出，转“全鱼”基因黄河鲤鱼与普通黄河鲤鱼在食品安全方面具实质等同性［17－18］。但一份转基因动物的制备过程中，会用到逆转录病毒序列，采用逆转录病毒序列可能会出现与野生病毒发生重组的危险，从而产生一种新型的逆转录病毒［19－20］。插入的 DNA片段会激活潜在的病毒，但是也有人认为动物细胞可以抑制内源病毒序列的活性［19］。以转基因动物作为食物，对其消化不足将会导致外源激素的摄入，外源激素的添加对动物体或者人体正常功能的运行有何影响尚且未知。英国《独立报》披露了转基因食品巨头孟山都公司的一份秘密报告，给小鼠喂食转基因玉米后，发现其血液发生变化，肾脏出现异常［20］。

2.2.8 基因芯片检测技术 基因芯片技术是鉴别微生物和转基因成分最有效的手段之一，为全面、快速、准确地进行食品安全检测提供了一个崭新的平台。基因芯片（DNA芯片、DNA微阵列）技术是近十几年来在生命科学领域迅速发展起来的一项高新技术，是一项基于基因表达和基因功能研究的革命性技术，它综合了分子食品工程 、微生物学、半导体微电子、激光、化学染料等领域的最新科学技术，在生命科学和信息科学之间架起了一道桥梁，是当今世界上高度交叉、高度综合的前沿学科和研究热点。目前基因芯片正在成为食品和食品原料检测中一种较新的方法，检测食品的营养成分，监督食品的卫生、安全和食品质量，保证人类健康，并且将对整个食品领域产生深刻的影响。与传统的检测方法（细菌培养、生化鉴定、血清分型等）相比，基因芯片技术的先进性主要体现在：①基因芯片可以实现微生物的高通量和并行检测，一次实验即可得出全部结果；②操作简便快速，整个检测只需4h基本可以出结果（而传统方法一般需4d～7d）；③特异性强，敏感性高。

尽管基因芯片技术的研究和应用前景十分诱人，但作为一项新技术，仍有一些问题需要解决：①该技术需要大量的已测知的、准确的DNA、cDNA片段的信息，它们使该技术成为大规模、集成化和整体获取生物信息的有效手段；②由于芯片制作工艺复杂，信号检测也需专门的仪器设备，一般实验室难以承担其高昂的费用；③样品制备和标记比较复杂，没有一个统一的质量控制标准；④实验室不能共享数据和资料库等。这些都在一定程度上限制了基因芯片技术在食品检测中应用。为使基因芯片成为实验室研究或实践中可以普遍采用的技术，须从以下几方面着手解决问题：①提高基因芯片的特异性、重复性；②简化样品制备和标记操作；③增加信号检测的灵敏度；④ 研制和开发高度集成化的样品制备、基因扩增、核酸标记及检测仪。

2.2.9 转基因动物食品的安全性检测

（1）转基因动物的健康状况检测 一般应用传统动物的健康指标被用作食物安全评估的参照物。评估应包括以下内容：①一般的健康特性指示，包括行为、生长、发育，解剖、生殖功能等；②生理生化健康指标，主要是血液常规指标，包括临床和分析参数；③转基因动物特异性指标，这种指标与健康动物相比没有实质性差异。

（2）用作转基因动物食品的潜在毒性或生物活性物质的评估 一是应证明在供体生物体中的已知毒素或抗营养素的编码基因没有转移到转基因动物中，与供体生物有关的常规食品加工技术，可能使其抗营养素或毒素失活、降解或消除。二是对蛋白质而言，对潜在毒性评估的重点应放在分析该蛋白质与已知蛋白毒素和抗营养素物质的氨基酸序列相似性、热稳定性或加工稳定性以及在典型胃肠道模式。当证明食物中的蛋白质与常规食物中安全食用蛋白质无序列相似时，则需要进行适当的口服毒性研究进行进一步的证明［21］。

未曾安全食用的非蛋白物质的潜在毒性，应根据对该物质的识别和动物的生物学功能及膳食接触情况进行个案评估。根据传统的毒理学方法开展检测，主要包括代谢、毒物动力学、亚慢性毒性、慢性毒性、致癌性、生殖及发育毒性等。若有表达的生物活性物质存在，应当评估这些物质对转基因动物健康的潜在效应。若这些物质在食用后存在生物活性，应考虑对人类的潜在影响。

潜在毒素的评估需要从转基因动物中分离这些新物质，或者合成这些物质。如果是合成的物质，这些物质应被证明在生化、结构和功能方面与转基因动物产生的相同。

（3）转基因动物食品（蛋白质）的致敏性评估在转基因动物的最终食物中，应评估所有新表达的蛋白质是否会引起过敏反应，或者食物中的某种新的蛋白质会对某些人群引发过敏反应。目前还没有试验可以准确预测人类对新表达蛋白质的过敏反应，因此应采取整合的、逐步、个案的方法来评估新表达蛋白质的潜在致敏性［22］。

除了对于转基因动物食品致敏性评估以外，还必须进行胃蛋白酶抗性测定，如果存在胃蛋白酶，某蛋白质在适当的条件下呈现降解抗性，提示需要进一步分析，以确定新表达的蛋白质是否有致敏的可能性。

对来源于已知致敏原的蛋白质，或与某一致敏原的序列同源的蛋白质，若能获得血清，应进行免疫学分析。经临床验证对该蛋白质来源过敏个体的血清，可以用于体外测定该蛋白质对IgE类抗体的特别结合。对非已知致敏原来源的蛋白质和没有呈现与已知致敏原序列同源的蛋白质，可以考虑用于筛选目标血清。来自某个已知致敏原的新表达的蛋白质，若体外免疫测定为阴性，还应进行其他试验，比如皮试和离体试验等，该试验的阳性结果就会提示它是一个潜在致敏原。

（4）转基因动物食品的关键组分分析 转基因动物关键组分的含量分析，特别是食物的典型组分的含量，应与在同等条件下饲养的传统对照物（近亲系）的等效组分进行比较，确定变化参数应在自然变异范围内。除此以外，在致敏性的评估中，还应确定引入的蛋白质的来源，包括：供筛选用的血清，记录在案的过敏反应的种类、程度和频率；结构特性和氨基酸序列；同一来源的已知为致敏蛋白的理化属性和免疫特性。

（5）转基因动物食品的储藏和加工测定 应考虑食品加工（包括在家庭制备食品）对转基因动潜在影响，例如在加工后，内源性有毒物对热的稳定性及重要营养素的生物有效性都可能发生改变，因此应提供该动物配料加工生产条件的信息。若遗传修饰的目的是为了改变储藏性状，应评估该修饰对食物安全和营养品质的影响。

（6）转基因动物食品的预期的营养修饰评估 对特殊人群，像婴儿、孕妇、哺乳期妇女、老年人及患慢性病或免疫功能低下的人群，应特别关注其生理特点和代谢要求。当修饰导致某种食物产品的成分构成与其传统对照物差异极大时，应利用其他的传统食品或食物成分（例如，与转基因动物动物食物的营养成分相近的食品或食物组分）作为对比物来评价营养修饰。若转基因动物食品的营养素的期望效应发生改变，或者其组成成分与传统食物不能相比，则需要进行动物饲养试验来研究［22－23］。

（7）转基因动物食品的非预期效应的评估 可能因插入DNA序列或重组DNA动物通过随后的传统育种而引起非预期效应。安全性评估应包括降低来自转基因动物食品对人类产生非预期不良反应的可能性方面的数据和信息。某些转基因动物表现的一些特征可能导致一些外源化学物质累积，例如兽药残留，重金属积累等，在转基因动物中通过改变人类病原菌通道，或者和新的产毒生物共生，潜在的改变移植，这些都可能影响食物安全。安全性评估应重点评估这些方面的变化。

3 结束语

转基因动物及其食品是解决未来人类社会资源短缺，食物不足的主要方法，对于转基因动物及其食品对人体的无害和有害评估，目前还只是根据现有知识和技术水平的一种推测和判别，因此，我们必须在借鉴发达国家经验的基础上，根据我国的国情特点，加快转基因动物及其食品安全评价技术的自主研发和创新。在保证转基因动物及其食品安全的条件下，促进转基因动物及其食品的开发和推广应用。

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