参芪强心口服液对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡、Bcl-2蛋白表达的影响

贾清华 张万义 高 华 (北京市西山医院,北京 0044)

凋亡所致的心肌细胞死亡与慢性充血性心力衰竭(CHF)密切相关〔1,2〕。细胞凋亡的调控涉及许多基因,Bcl-2基因家族是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族,属于一类新的癌基因家族〔2〕,许多研究表明 Bcl-2是抑制凋亡的主要基因。近年来研究采用中医药对心肌细胞凋亡干预手段来防治 CHF。本试验以腹主动脉结扎所致CHF观察对模型大鼠的Bcl-2基因蛋白表达、心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性 Wistar大白鼠 40只,购自山东大学实验动物中心,体重 250～300g。

1.1.2 主要试剂与药品

1.1.2.1 主要试剂 DeadEndTM荧光 TUNEL试剂盒(美国Promega公司);Bcl-2兔多克隆抗体(美国 Santa Cruz公司);PV-6001二步法免疫组化检测试剂盒、浓缩型二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(均购自北京中杉生物技术有限公司);DNase I(RNase Free)和 DNase I Buffer(大连保生物工程有限公司);Propidium Iodide(美国 Sigma公司),Anti-Mouse Cy3(Clontech公司)。

1.1.2.2 实验药品 参芪强心口服液(主要包含党参、炙黄芪、柴胡、当归、川芎等),含生药材 2.63g/ml(由胜利医院制剂室制备)。卡托普利片(上海医药集团有限公司,批号:030104)。

1.2 方法

1.2.1 慢性心衰模型制备 取 Wistar大鼠,10%水合氯醛0.3ml/100 g腹腔注射麻醉,固定,消毒,经腹正中线开腹,纵向切口约 2cm,钝性分离暴露腹主动脉。以直径为 0.7 mm的不锈钢探针与腹主动脉一起结扎。然后小心抽出探针形成腹主动脉狭窄(约 50%),同时腹腔一次性注射 10万单位青霉素,关腹缝合。假手术组除丝线不结扎外,其余操作均同模型组。

将造模动物分笼,常规饲养,大鼠腹主动脉缩窄法并加以改良制作慢性心衰动物模型4 w后出现气喘、尿少、食欲下降、水肿、爪甲发绀等症状和体征。与对照组比较食量下降,尿量减少,水肿、爪甲发绀明显,心电图显示心率加快。与临床 CHF症状体征相似,病理切片见心、肝、肺组织形态上分别出现:左心室心肌肥厚,肌纤维排列紊乱或断裂、炎症,肝脏微血管扩张、瘀血,肺泡壁破裂融合,间质水肿、充血、此时提示 CHF大鼠模型成功。

1.2.2 实验分组和给药方法 4w后将实验动物随机分组,将模型动物分为 3组,分别为CHF模型组,强心口服液组和卡托普利组,另将假手术组作为空白对照组,每组均为 10只。强心口服液组按 5.26 g/200 g生药的剂量灌服;卡托普利组按5.0mg/200g剂量灌服;假手术组灌胃2.0ml/200g生理盐水,连续用药 1个月后,分别检测待查指标。

1.2.3 Bcl-2蛋白检测 免疫组化检测(PowerVision二步免疫组化法)Bcl-2蛋白。阳性标准:以细胞质呈棕褐色为Bcl-2蛋白阳性表达。免疫组化在显微镜 200倍下用图像分析系统测量平均光密度值(AOD),每组选 10个视野分别测量,然后计算均值作为此组的代表值。

1.2.4 心肌凋亡细胞检测 末端标记原位细胞凋亡法(TUNEL)检测心肌凋亡细胞。阳性标准:以细胞核呈绿色表示心肌凋亡细胞阳性,细胞核呈红色表示心肌坏死。在显微镜400倍下观察每个视野中的凋亡细胞数,计算平均荧光强度,每个切片计数 4个视野,然后取其均值作为本组的代表值。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件进行处理,数据以±s表示,采用单因素方差分析法(检验),组间比较采用 SNK-q检验。

2 结 果

2.1 参芪强心口服液对 CHF大鼠 Bcl-2蛋白表达的影响CHF模型组 Bcl-2蛋白表达与假手术组相比明显降低,有显著性差异(P＜0.05);强心口服液组与模型组相比,Bcl-2表达明显增高,有显著性差异(P＜0.05);卡托普利组 Bcl-2表达有增高的趋势,但差异不显著。见表 1,图 1。

表1 参芪强心口服液对慢性心衰大鼠Bcl-2蛋白表达及细胞凋亡的影响(±s)

表1 参芪强心口服液对慢性心衰大鼠Bcl-2蛋白表达及细胞凋亡的影响(±s)

与假手术组相比:1)P＜0.05,2)P＜0.01;与模型组相比:3)P＜0.05

组别 n Bcl-2(AOD) 凋亡细胞数假手术组 10 639.8±397.5 3.92±2.74模型组 10 319.6±153.91) 15.92±12.492)强心口服液组 10 486.2±160.93) 7.52±4.041)3)卡托普利组 10 416.3±268.0 9.03±5.101)3

2.2 参芪强心口服液对 CHF大鼠细胞凋亡的影响 模型组与假手术组相比,心肌组织细胞凋亡明显增多,有极显著性差异(P＜0.01);强心口服液组、卡托普利组与模型组相比,均能显著降低慢性心衰大鼠的凋亡发生率,有显著性差异(P＜0.05)。 见表 1,图 2。

图1 参芪强心口服液对慢性心衰大鼠Bcl-2蛋白表达的影响(×400)

图2 参芪强心口服液对慢性心衰大鼠细胞凋亡的影响(×400)

3 讨 论

黄芪扩张实验小鼠冠状动脉,改善心肌微循环,增加冠脉血流量及心肌营养血流量,并对抗因垂体后叶素引起的心肌缺血;可扩张因去甲肾上腺素所致的金黄地鼠颊囊微血管的收缩,增加血管口径。还可改善心肌营养,降低心肌耗氧量,使氧的供需维持平衡,并可稳定细胞膜,从而减轻心肌细胞的损伤。党参能提高缺血/再灌注损伤心肌超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低丙二醛(MDA)含量,减少 CK的释放,使心肌的收缩和舒张功能得到明显改善,并能促进心输出量、冠脉流量,每搏输出量及心率的恢复,提示党参对缺血/再灌注所致心肌脂质过氧化损伤有一定的保护作用。研究表明〔3〕党参具有增强心肌收缩力和改善左室舒张功能以及左室舒张期充盈增加的作用。当归使离体兔心或麻醉狗冠脉扩张、血压下降及心肌耗氧量减少,并缓解垂体后叶素性心肌缺血,心电图 T波显著降低〔4〕。当归煎剂、水提取物及其有效成分阿魏酸钠均能增加小鼠摄取86Rb的能力,使心肌营养性血流量明显增加;当归尚能扩张外周血管、降低血管阻力,使股动脉、脑动脉及冠状动脉的血流量均增加,其作用机理可能与胆碱能受体和组胺受体兴奋有关;当归及其有效成分阿魏酸钠有抑制血小板聚集防止血栓形成作用,当归水剂和阿魏酸钠的有些体外抗血栓作用比阿司匹林还强;对凝血酶诱导的血小板聚集有明显抑制作用,也能抑制3-5羟色胺(3H-5HT)从血小板中释出,说明当归和阿魏酸钠抑制血小板聚集系统通过抑制血小板释放反应而产生,这可能与抑制血栓素 A2(TXA2)合成有关;阿魏酸钠还参与前列环素(PGI2)-TXA2平衡调节。川芎水提取物及其生物碱能扩张冠状动脉增加冠脉血流量,改善心肌缺血;能降低小鼠心肌耗氧量;据研究川芎嗪也有改善左心功能的作用。知母虽不能直接改善心功能,但能显著降低心率,有一定的降压作用,降低大鼠血浆儿茶酚胺浓度,也说明知母有抗肾上腺素能的作用;其药理效应与美托洛尔相似〔5〕。

近年来的一些研究表明:心衰发生时左室功能的不断恶化是心肌细胞凋亡或(和)剩余的心肌细胞收缩功能代偿不足的结果。而凋亡可能是心肌细胞不断丢失的根源所在 。细胞凋亡在心力衰竭中起到重要的作用,阻止细胞凋亡能减轻心脏重构和心力衰竭的程度〔6〕。本实验提示参芪强心口服液通过上述作用,保护心肌细胞,延缓或逆转心力衰竭进程。

bcl-2基因是位于人滤泡性淋巴瘤的 t(14;18)染色体上的癌基因。Bcl-2基因及其蛋白可抑制多种组织的细胞凋亡,Surendran等通过Bcl-2脂质体转染细胞,Bcl-2反义寡核苷酸处理细胞等方法证实 Bcl-2基因过高表达能明显延长细胞寿命,减少细胞凋亡〔7〕。本研究表明参芪强心口服液通过调控心衰大鼠心肌细胞的凋亡基因Bcl-2等途径抑制心肌细胞的凋亡。

1 Colucci WS.Molecular and cellular mechanisms of myocardial failure〔J〕.Am JCardiol,1997;80(11A):15-25.

2 Green DR,Kroemer G.The pathophysiology of mitochondrial cell death〔J〕.Science,2004;305(5684):626-9.

3 赵悦如.多普勒测试党参口服液对冠心病心功能改善的研究〔J〕.北京中医药大学学报,1996;19(3):49.

4 姜春华.活血化瘀研究新编〔M〕.上海:上海医科大学出版社,1990:1,475.

5 胡宇驰,侯家玉 .知母、黄芪对小鼠实验性心肌肥厚及应激反应能力的影响〔J〕.中国中药杂志,2003;28(4):369-74.

6 Garg S,Narula J,Chandrashekhar Y.Apoptosis and heart failure:clinical relevance and therapeutic target〔J〕.JMol Cell Cardiol,2005;38(1):73-9.

7 Surendran S.Gopinathan P.Anti-apoptotic Bcl-2 gene transfection of human articular chondrocytes protects against nitric oxide-induced apoptosis〔J〕.J Bone Joint Surg Br,2006;88(12):1660-5.