补肾方药血清孵育 BMSCs移植对脑缺血大鼠脑组织细胞凋亡的影响

刘永琦 吴晓晶 董介正 范 萍 孙少伯 颜春鲁 (甘肃中医学院,甘肃 兰州 730020)

脑缺血性梗死是一种高发病率、高死亡率和高致残率的疾病,严重威胁人类健康。细胞凋亡是造成脑缺血再灌注后迟发性持续神经细胞损伤不可忽视的重要因素〔1〕。因骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有易于获得、体外培养能快速扩增、可自体移植并能够转染和长期表达外源性基因等特征,使其极具研究优势。近年来研究发现,BMSCs能局部和静脉注射移植治疗中枢神经系统损伤〔2～5〕。中医药在神经系统疾病的治疗上具有显著疗效,补肾生髓法是临床上治疗脑血管疾病的常用治法。本文采用补益肾阳法、补益肾阴法、阴阳双补法的代表方剂右归丸、左归丸、地黄饮子的动物含药血清孵育BMSCs并移植到脑缺血大鼠体内,探讨不同补肾法方药孵育BMSCs对大鼠脑缺血再灌注模型脑组织细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Wistar大鼠,SPF级,8只,雌雄不限,体重(120±10)g,用于提取 BMSCs;40只,雌雄不限,体重(250±20)g,用于制备中药血清;84只,雌雄各半,体重(300±30)g,用于实验造模。以上动物皆由甘肃中医学院实验动物中心提供,实验动物质量合格证许可证编号:SCXK(甘)2004-0006-000001。

1.1.2 实验药物 左归丸、右归丸、地黄饮子均购于甘肃中医学院附属医院药剂科,方药组成及剂量均参照第7版方剂学教材。

1.1.3 主要试剂和仪器 L-DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司);0.25%胰酶(Sigma公司);全反式维甲酸(ATRA,Sigma公司);CD45、CD90荧光标记抗体(Gibco公司);细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL)、兔抗大鼠 Caspase-3(武汉博士德生物工程有限公司);二氧化碳培养箱 (SANYO公司);超净工作台(苏州净化仪器厂);流式细胞仪(Beckman公司);荧光显微镜(Olympus)。

1.2 方法

1.2.1 动物含药血清的制备 水煎法分别制备右归丸、地黄饮子、左归丸药液(1 g生药/ml)。40只 Wistar大鼠依照随机数字表分为空白组、右归丸组、地黄饮子组、左归丸组。晚禁食,空白组按 10 ml/kg的量予以生理盐水灌胃,余各组按10 ml/kg量灌服相应方药煎剂,连续 3 d,2次/d;于第 3 d给药后 2 h取血,分离血清,灭活、除菌、分装,-20℃保存备用。

1.2.2 BMSCs的分离、纯化 将大鼠脱臼处死,无菌条件下取出双侧股骨,除去骨表面附着组织,剪去两端,用体积分数为75%的乙醇浸泡消毒 5～8 min,用含 10%胎牛血清的 DMEM培养液反复冲洗骨髓腔,收集冲洗液,1 000 r/min,10 min离心,弃去上清液,重新加入含 10%胎牛血清的 DMEM,用尖吸管吹打均匀;调整细胞密度,以 1×106个/ml的密度将细胞悬液接种到容量 25cm2培养瓶中,于 37℃、体积分数为 0.05的CO2培养箱中进行原代培养,每 3～4天换液 1次。待 BMSCs生长至 80%～90%融合时,用质量浓度为 0.25%的胰酶消化传代。

1.2.3 BMSCs的鉴定 获得第 3代 BMSCs,加入荧光标记CD90、CD45抗体,用流式细胞仪检测细胞表面 CD90、CD45表达率。

1.2.4 BMSCs的孵育 将传至第 3代的 BMSCs分别用内含10%空白组的大鼠血清的 DMEM培养液、0.01 mg/L ATRA、10%FBS L-DMEM培养液、10%相应含药血清的 DMEM培养液于 37℃、气体体积分数为 5%CO2培养箱内,饱和湿度条件下培养孵育。

1.2.5 局灶性脑缺血动物模型制备及实验动物分组 采用Yuji等〔6〕所报道的线栓法建立 Wistar大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO)。参考Longa及Bederson评定神经功能缺损程度,对造模成功的大鼠按随机数字表法随机分为模型组、空白血清孵育 BMSCs移植组(简称 BMSCs组)、维甲酸孵育 BMSCs组(维甲酸组)、右归丸血清孵育 BMSCs组(右归丸组)、地黄饮子血清孵育 BMSCs组(地黄饮子组)、左归丸血清孵育 BMSCs组(左归丸组),另假手术组对照组。每组每个时间点各 6只。

1.2.6 BMSCs的移植 移植前对细胞进行消化后离心,收集,用生理盐水漂洗 3次,进行细胞计数,重悬,每 1ml生理盐水的细胞个数为 1×106个/ml,假手术、模型组大鼠尾静脉注射生理盐水1ml,其余各组大鼠于造模 24h后经尾静脉输入等量相应中药孵育后的 BMSCs。

1.2.7 取材与标本处理 分别于移植后 7、14 d(每个时间点各 6只)用 10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,手术充分暴露心脏,用4%的多聚甲醛溶液经升主动脉进行灌注固定,断头后剪开颅板取出全脑,以前囟为中心前后 1 mm(病变损害的中心),冠状切取大鼠脑组织,置于 4%多聚甲醛固定液中,常规石蜡包埋,待做免疫组化测定。

1.2.8 TUNEL法检测脑组织细胞凋亡的变化 将石蜡包埋标本行冠状切片,按试剂盒说明书进行操作。阳性反应细胞的胞质为棕黄色;随机选取缺血侧皮层 5个视野;每组观察 6张切片,合计 30个视野;计数阳性细胞,计算平均值。

1.2.9 Caspase-3表达的变化 采用免疫组织化学法,石蜡包埋标本行冠状切片,按试剂盒说明书进行操作。阳性反应细胞的胞质为棕黄色;随机选取缺血侧皮层 5个视野;每组观察 6张切片,合计 30个视野;计数阳性细胞,计算平均值。

1.3 统计学处理 应用 SPSSl 6.0统计软件进行分析,结果数据以±s表示,多样本均数比较采用方差分析。

2 结 果

2.1 BMSCs的分离、鉴定及孵育 原代细胞培养 3d后观察,即可见大量贴壁细胞,细胞完全舒展并呈现多种形态,主要为长梭形、成纤维样;4～5 d左右细胞数量明显增加,集落渐扩大,约8～9d基本铺满瓶壁形态为较均一长梭形。原代培养过程中可见部分悬浮造血细胞,经数次换液后其基本消失。传代细胞呈均匀分布,生长迅速,约3～4 d可铺满瓶壁,细胞多呈梭形。且传至 3代的细胞形态单一均匀,融合后呈典型的极性,漩涡状生长。经流式细胞术检测,所培养的 3代BMSCs高表达BMSC表面标志分子 CD90(97.1%),而极低表达造血细胞表面分子 CD45(0.1%),CD90+CD45-细胞为 97.1%,符合 2006年国际细胞治疗协会(ISCT)给出的 BMSC的定义标准〔7〕。

2.2 各组大鼠脑组织细胞凋亡的变化 假手术组有少量阳性表达,模型组 7d、14 d缺血中心区和半暗带区脑组织细胞凋亡数较假手术组显著增多(P＜0.01)。与模型组比较,各治疗组7 d、14d脑组织细胞凋亡数减少显著(P＜0.05,P＜0.01)。地黄饮子组、左归丸组 7 d、14 d脑组织细胞凋亡数与 BMSCs、维甲酸、右归丸组比较显著减少 (P＜0.05,P＜0.01)。

2.3 各组大鼠脑组织 Caspase-3表达的变化 假手术组有少量 Caspase-3阳性表达,模型 7 d、14 d组较假手术组明显增多(P＜0.01)。与模型组比较,各移植组 7 d、14 d的 Caspase-3表达均有显著减少,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01)。地黄饮子组、左归丸组 7 d、14 d脑组织的 Caspase-3表达与 BMSCs、维甲酸、右归丸组比较显著减少,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01)。见表 2。

表1 各组大鼠脑组织TUNEL阳性细胞比较(个/HP,±s)

表1 各组大鼠脑组织TUNEL阳性细胞比较(个/HP,±s)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05,3)P＜0.01;与 BMSCs组比较:4)P＜0.05,5)P＜0.01;与维甲酸组比较:6)P＜0.05,7)P＜0.01;与右归丸组比较:8)P＜0.05,9)P＜0.01;下表同

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表2 各组大鼠脑组织 Caspase-3表达变化比较(个/HP,±s)

表2 各组大鼠脑组织 Caspase-3表达变化比较(个/HP,±s)

分组 n 7 d 14 d假手术组 6 10.03±1.38 9.70±1.68模型组 6 26.13±4.401) 24.03±4.571)BMSCs组 6 24.10±4.662) 22.03±4.252)维甲酸组 6 22.07±4.563)4) 20.10±4.023)4)右归丸组 6 23.73±4.132) 21.80±4.292)左归丸组 6 19.53±3.913)5)6)9) 17.70±3.723)5)6)9)地黄饮子组 6 18.87±3.163)5)7)9) 16.77±3.073)5)7)9)

3 讨 论

BMSCs易于体外分离、扩增,具有良好的多向分化潜能等优良特征而被认为是可用于临床细胞学治疗的最佳干细胞之一〔8,9〕。脑缺血再灌注损伤后引起能量衰竭和酸中毒,产生大量的自由基、兴奋性氨基酸对脑细胞产生损害,磷脂代谢的异常、积聚,同时促使离子自稳机制破坏,导致细胞内钙超载,这些最终引起某些原癌基因的表达,诱导凋亡的发生。脑缺血后,神经元的死亡是一个极其复杂的病理过程,主要表现为坏死和凋亡两种形式,在脑缺血急性期,神经元坏死与凋亡并存,细胞坏死位于缺血中心区,细胞凋亡主要出现在缺血半暗带。而在脑缺血的迟发性神经元死亡期,则以细胞凋亡为主。Caspase家族可特异地在天门冬氨基酸残基后裂解靶蛋白。Caspase-3是 Caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行蛋白酶。在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用。在神经系统中 Caspase-3不仅可以促进脑发育时期神经元的凋亡,还可以促进各种因素诱导培养的神经元凋亡,Caspase-3可能是缺血神经元凋亡的重要效应分子〔10〕。本研究结果表明,BMSCs移植能减少脑缺血大鼠脑组织细胞凋亡数,抑制 Caspase-3的阳性表达。提示抑制脑组织细胞凋亡可能是BMSCs移植治疗脑缺血损伤的作用机制之一。

1 楚 冰,邵国富.脑缺血后迟发性神经元死亡及分子机制〔J〕.国外医学◦脑血管疾病分册,1999;7(6):330-2.

2 Chopp M,Zhang XH,Li Y,et al.Spinal cord injury in rat:treatment with bone marrow stromal cell transplantation〔J〕.Neuroreport,2000;11(13):3001-5.

3 Chen J,Li Y,Wang L.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats〔J〕.Stroke,2001;32(4):1005-11.

4 曹勇军,程彦斌.线栓法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的改进与探讨〔J〕.中国应用生理学杂志,2001;17(2):198-200.

5 许予明,秦 洁,邢 莹,等.体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化〔J〕.郑州大学学报(医学版),2004;39(2):269-71.

6 Yuji K,Kazuo M,Takenori Y,et al.Nylonmomofilament for intraluminal middle cerebral artery ocelusion in rat〔J〕.Stroke,1995;26:1655-7.

7 Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular herapy position statement〔J〕.Cytotherapy,2006;8(4):315-7.

8 覃小华,尚希福.骨髓间充质干细胞横向分化及临床应用研究进展〔J〕.医学综述,2009;15(1):38-40.

9 范 萍,刘永琦,吴晓晶,等.不同条件下骨髓间充质干细胞分离培养及其生物学特性研究〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,2010;26(4):322-4.

10 Yuan J,Yankner BA.Apoptosis in the nervous system〔J〕.Nature,2000;407(6805):802-9.