酸樱桃汁对衰老模型小鼠的抗衰老作用及其机制

王春梅 李香艳 崔新颖 (北华大学药学院,吉林 吉林 132013)

研究表明樱桃富含多种维生素、花青素、各种花色苷、花色素、褪黑激素、多种酚类化合物等有效成分,具有调节睡眠、清除自由基、抗氧化、抗炎、镇痛、抗癌、保护心血管系统功能、降低血脂、改善糖尿病等作用〔1〕。而近年国外研究资料显示酸樱桃含有更为丰富的酚醛类物质如花色苷等,其药用价值远远高于甜樱桃〔2〕,但国内有关酸樱桃的药理学研究报道较少。本研究采用从加拿大 Alberta引进的 Evans和 SK Carmine Jewel高产、优良和抗逆性强的酸樱桃新品种,自制酸樱桃汁(PCLJ),利用 D-半乳糖衰老小鼠模型,通过行为学、功能学以及病理形态学等层面研究酸樱桃汁的抗衰老作用,并初步探讨其抗衰老作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 纯系昆明种小鼠,雌雄各半,6周龄,体重(20±2)g,由长春高新区医学实验动物中心提供,合格证号:SCXK 2(吉)200322004。各组小鼠同室分笼饲养,颗粒饲料喂养,自由饮水。

1.2 药品及试剂 PCLJ由北华大学药学院药理教研室自制;D-半乳糖购至国药集团化学试剂有限公司,批号:F20050711;维生素 E胶丸为昆明圣火制药有限责任公司生产,批号:20051002。丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、脂褐素、胆碱酯酶(AChE)检测试剂盒均购自南京建成生物技术有限公司。

1.3 模型建立及给药方法 昆明种小鼠适应性饲养 1 w后,将动物随机分为 6组:正常对照组、衰老模型组、维生素 E组、PCLJ低、中、高剂量组,每组 20只。模型组和给药组小鼠每日接受颈背部皮下注射 D-半乳糖 120 mg/kg(生理盐水配制),连续 8 w〔3,4〕,对照组注射等量的生理盐水;同时给药组小鼠每日分别灌胃相应剂量的维生素 E(50 mg/kg)或 PCLJ(5,10,20 ml/kg),正常对照组和衰老模型组小鼠灌胃等量的生理盐水,连续 8w。

1.4 学习记忆能力测试(小鼠跳台实验) 实验装置为一长方形反射箱,大小为 32 cm ×22.5 cm ×33 cm,用黑色塑料板分隔成 6间。底面铺以铜栅,间距为 0.5 cm,每间左角置一高度和直径均为 4.5 cm的橡胶平台。将小鼠放入反应箱内适应环境 3 min,然后立即通以 32 V交流电,其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。如此训练 5 min,24 h后重做测试,记录动物第 1次跳下平台的潜伏期和 5 min之内跳下平台受到电击的次数(错误次数)〔5〕。

1.5 检测指标 学习记忆实验结束后,准确称量每只小鼠体重并记录。断头处死后立即于冰台上取出全脑、胸腺、脾组织,用预冷的生理盐水反复冲洗,用滤纸吸干,电子天平称量全脑、脾和胸腺的重量。用于切片的脑组织置于10%甲醛中固定,其余脏器组织用锡箔纸包好,置-80℃超低温冰箱保存待用。

1.5.1 各脏器指数的测定 准确称取小鼠全脑、胸腺、脾脏湿重后,计算各脏器指数(mg/g)〔胸腺重量(mg)/体重(g)〕。

1.5.2 脑组织中生化指标的测定 将冻存的脑组织放入组织匀浆机配用的玻璃管中,加入 9倍体积预冷的生理盐水(蒸馏水),充分研磨后,制成 10%脑组织匀浆。采用考马斯亮蓝法测定脑组织匀浆中总蛋白含量;硫代巴比妥酸反应物法测定MDA含量;酶法检测GSH-Px和AChE的活性;荧光法测定脑组织中脂褐素含量。具体检测方法参照试剂盒说明书。

1.6 小鼠大脑组织病理形态学检测 取 10%甲醛溶液固定的脑组织标本,切取左、右大脑顶部及颞部皮质组织(4 mm×4 mm×3 mm),将其置于 70%、80%的酒精中各漂洗 15 min,然后以 90%、100%酒精,100%酒精+丙酮,二甲苯依次脱水,透明,浸蜡,包埋,制成 4μm石蜡切片,行苏木素-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察、拍照。

2 结 果

2.1 PCLJ对衰老小鼠跳台实验的影响 在第 1天的学习测试中,模型组小鼠 5 min内错误次数较正常对照组明显增多,PCLJ中、高剂量组小鼠 5 min内错误次数较模型组明显减少(P＜0.01,P＜0.001)。在第 2天的记忆测试中,模型组小鼠第1次跳下平台的潜伏期较正常对照组显著缩短,5 min内错误次数明显减少(P＜0.001),PCLJ低、中、高剂量组小鼠第 1次跳下平台的潜伏期明显延长,5 min内错误次数明显减少(P＜0.05～0.001),并呈剂量依赖性。见表 1。

2.2 PCLJ对衰老小鼠脏器指数的影响 与正常对照组比较,模型组小鼠脑、胸腺、脾指数均显著减小(P＜0.01～0.001)。PCLJ低、中、高剂量组小鼠脑、胸腺、脾指数明显增大,并呈剂量依赖性。见表 2。

2.3 PCLJ对衰老小鼠脑组织 MDA、GSH-Px、AChE及脂褐素的影响 与正常对照组比较,模型组小鼠脑组织 MDA及脂褐素含量显著提高,差异有统计学意义(P＜0.01),GSH-Px活性明显降低(P＜0.01),而 AChE活性明显升高。PCLJ中、高剂量组小鼠脑组织MDA及脂褐素含量显著降低,GSH-Px活性明显升高,AChE活性显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01),并呈剂量依赖性。见表 2。

表1 PCLJ对衰老小鼠跳台实验的影响(±s,n=20)

表1 PCLJ对衰老小鼠跳台实验的影响(±s,n=20)

与正常对照组比较:1)P＜0.01,2)P＜0.001;与模型组比较:3)P＜0.05,4)P＜0.01,5)P＜0.001,下表同

组别 剂量(ml/kg)错误次数(次) 记忆能力(5 min)潜伏期(s) 错误次数(次)正常对照组 - 2.87±0.74 185.20±51.67 1.53±0.83衰老模型组 - 4.06±0.882)136.87±52.291) 2.87±0.922)PCLJ(低)组 5 3.33±0.82 179.00±57.373) 2.13±0.923)PCLJ(中)组 10 3.20±0.774)188.93±54.724) 1.93±0.804)PCLJ(高)组 20 2.93±0.705)207.67±57.995) 1.60±0.835)维生素 E组 50 mg/kg 3.53±0.743)176.80±55.593) 2.33±0.723)

表2 PCLJ对衰老小鼠脏器指数和脑组织中生化指标的影响(±s,n=20)

表2 PCLJ对衰老小鼠脏器指数和脑组织中生化指标的影响(±s,n=20)

组别 剂量(ml/kg)脑指数(mg/g)胸腺指数(mg/g)脾指数(mg/g)MDA(nmol/ml)GSH-Px(U)AChE(U/mgprot)脂褐素(μg/g)正常对照组 - 14.53±1.12 2.17±0.16 3.18±0.29 4.96±0.21 0.27±0.04 0.28±0.06 0.523±0.056衰老模型组 - 12.51±1.132) 1.77±0.272) 2.76±0.271) 5.46±0.261) 0.23±0.031) 0.36±0.071)0.638±0.0841)PCLJ(低)组 5 13.37±0.923) 1.89±0.19 2.97±0.183) 5.28±0.36 0.24±0.02 0.32±0.01 0.590±0.036 PCLJ(中)组 10 13.63±0.894) 2.01±0.323) 3.05±0.264) 5.18±0.272) 0.25±0.032) 0.30±0.022)0.576±0.0322)PCLJ(高)组 20 14.06±0.895) 2.12±0.204) 3.18±0.275) 4.98±0.393) 0.27±0.033) 0.29±0.023)0.548±0.0573)维生素 E组 50 mg/kg 13.28±0.783) 1.94±0.21 2.96±0.203) 5.35±0.225 0.25±0.032) 0.31±0.032)0.581±0.0512)

2.4 PCLJ对衰老小鼠脑组织病理形态学的影响 正常对照组小鼠大脑皮质神经细胞丰富,排列整齐,着色正常;模型组小鼠大脑皮质神经细胞数量显著减少,排列疏松,残存神经细胞固缩变圆,着色变浅;PCLJ低剂量组小鼠大脑皮质神经细胞形态结构介于正常对照组和衰老模型组之间;PCLJ高剂量组小鼠大脑皮质神经细胞略减少,部分神经细胞胞体变小或者淡染。

图1 PCLJ对衰老小鼠脑组织病理形态学的影响(HE,×100)

3 讨 论

本研究采用 D-半乳糖小鼠皮下注射 8 w,造成亚急性衰老小鼠模型〔6〕,其一般状态欠佳,跳台实验结果表明模型组小鼠学习记忆能力显著减退,而PCLJ治疗组小鼠毛色光泽、精神状态良好,学习记忆能力明显改善。

组织器官的重量,特别是脑、胸腺、脾、肝、肾等重要器官的重量变化是反映生物体衰老程度的重要指标〔7〕。免疫器官衰变最明显的是胸腺和脾,胸腺和脾重量的降低、萎缩、功能衰退可使免疫功能降低,导致老年动物(人)恶性疾病发生率增高,加速老化进程。本研究结果显示 D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠脑、胸腺和脾脏指数均显著下降,PCLJ治疗明显提高了衰老小鼠脑、胸腺及脾脏重量,说明PCLJ能够有效对抗小鼠脑的衰老,保持机体的免疫功能,提高抗病能力,从而对延缓衰老具有积极的意义。

衰老机体氧化系统和抗氧化系统的动态平衡遭到破坏。MDA是脂质过氧化的主要产物之一,其在脑组织中的水平随着年龄的增加而升高,可反映自由基对机体的损伤程度〔8〕。脂褐素是 MDA与含有游离氨基酸的蛋白质、磷脂酰乙醇胺及核酸等物质进一步作用形成的一种有自发荧光的复合物,终身存在于细胞内,又称老年色素,其含量随着老化增加,逐渐充盈细胞,甚至取代细胞核,是目前公认的老化标志之一。本实验表明 PCLJ可明显降低 D-半乳糖致衰老小鼠脑组织 MDA含量,中、高剂量组可显著降低脑组织脂褐素的含量,提示其可减轻脂质过氧化损伤,而发挥抗衰老作用。

GSH-Px是广泛存在于机体内的一种重要的催化过氧化分解的酶,它特异性地催化 GSH对过氧化氢的还原反应,抑制烟酸胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)形成 OH-,削弱对脂质过氧化作用的损伤,从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。本实验结果表明 PCLJ可显著提高 D-半乳糖致衰老小鼠脑组织GSH-Px活性,提高体内抗氧化酶活性,减轻自由基对生物大分子的伤害。研究表明中枢胆碱能神经功能与学习记忆密切相关〔9〕,乙酰胆碱(ACh)是经典的胆碱能神经递质,以兴奋作用为主,亦有抑制作用。ACh在调节学习和记忆尤其是近期记忆方面具有重要作用,是促进学习记忆的神经递质。而 AChE是水解 ACh的酶,AChE活性增高,间接说明胆碱能神经系统功能减退导致学习记忆障碍。本实验结果表明酸樱桃汁中、高剂量组小鼠脑组织 AChE活性较模型组明显降低,提示PCLJ对衰老模型小鼠的学习记忆有明显的改善作用,可能与抑制脑内AChE合成,减少 ACh水解,保护脑组织神经有关。

此外,病理形态学研究结果亦显示PCLJ能够明显改善D-半乳糖致衰老小鼠大脑皮质切片的形态结构改变。

酸樱桃果实具有清除自由基、抗氧化等作用,并能保护神经细胞免于氧化应激损伤,有很强的减慢神经退行性改变的作用〔10,11〕,从而改善衰老的行为学变化,提高衰老小鼠的学习记忆能力,延缓衰老的进程。本研究为将酸樱桃开发成为抗衰老功能性食品和药品提供了理论依据。有关酸樱桃抗衰老作用的分子机制及其主要有效成分仍需要进一步研究和探讨。

1 崔新颖,李香艳,孔祥雨,等 .酸樱桃果实有效成分及药理作用的研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2007;8(2):145-9.

2 Mulabagal V,Lang GA,DeWitt DL,Dalavoy SS,Nair MG.Anthocyanin content,lipid peroxidation and cyclooxygenase enzyme inhibitory activities of sweet and sour cherries〔J〕.J Agric Food Chem,2009;57(4):1239-46.

3 朱庆磊,杨 契,薛 桥,等 .人工致衰老和自然衰老小鼠抗氧化能力改变的对比研究〔J〕.中国老年学杂志,2003;23(7):448-50.

4 余资江,应大君,董世武,等 .半乳糖急性致衰老动物模型剂量的探讨〔J〕.解剖学杂志,2005;28(4):422-4.

5 张 丹,王亚芳,张建军 .藏药旺拉提取物 CE对亚急性衰老小鼠学习记忆及抗氧化能力的影响〔J〕.中国新药杂志,2005;14(11):1301-3.

6 Leutner S,Eckert A,Müller WE.ROSgeneration,lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in the aging brain〔J〕.J Neural Transm,2001;108(8-9):955-67.

7 刘 涛,王灿晖,杨 进,等 .改良三甲散抗脑衰老的实验研究〔J〕.中国老年医学杂志,2001;21(7):308-9.

8 师绣章.自由基导致衰老与自由基防衰老的研究〔J〕.中华老年医学杂志,1985;4(2):122-4.

9 Muir JL.Acetylcholine,aging,and Alzheimer′s disease〔J〕.Pharmacol Biochem Behav,1997;56(4):687-96.

10 Ramona Lichtenth,Friedhelm Marx.Total oxidant scavenging capacities of common european fruit and vegetable juices〔J〕.J Agric Food Chem,2005;53(1):103-10.

11 Kim DO,Heo HJ,Kim YJ,et al.Sweet and sour cherry phenolics and their protective effects on neuronal cells〔J〕.J Agric Food Chem,2005;53(26):9921-7.