熄风止颤合剂对 PSI诱导的帕金森病模型大鼠脑的影响

周风华 李文通 李媛媛 任 凡 刘雨清 (潍坊医学院病理学教研室,山东 潍坊 261053)

帕金森病(PD)是一种以运动机能障碍为主的老年神经退行性疾病,随着人口老龄化的加剧及寿命的延长,PD的发病率逐渐增高。其临床症状以肢体不自主震颤、肌肉强直、进行性运动迟缓为主。其病理学改变表现为黑质-多巴胺能神经元退化及纹状体多巴胺水平的降低。左旋多巴类药物是临床治疗PD最常用的药物,但长期服用此药会产生诸多的副作用,近年来中药治疗 PD逐渐受到重视。本实验采用皮下注射蛋白酶抑制剂(PSI)成功构建 PD慢性大鼠模型,观察熄风止颤合剂对PD大鼠行为学及大脑黑质多巴胺神经元的影响,探讨熄风止颤合剂对 PD的治疗作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠,雄性,36只,体重约 200 g,购自山东大学医学部实验动物中心。

1.1.2 药物 熄风止颤合剂由黄芪、当归、何首乌、白芍、龟板、天麻、三七粉、蜈蚣、水蛭、僵蚕、石菖蒲、胆星、甘草等组成,将每种中药成品按一定比例混合,加入蒸馏水,配制成混悬液,消毒玻璃瓶密闭盛装,冰箱 4℃保存备用。以上所有中药成品均由潍坊市中医院中风科提供。美多巴由上海罗氏制药公司生产,批号:010813,研磨成粉后溶解于蒸馏水中,配制成剂量为 200 mg/kg的混悬液,现配现用。

1.1.3 试剂 造模剂:PSI购自Calbiochem公司,Catalog number:539160,-20℃冷冻保存。PSI的溶解配制方法:将室温放置的 100%无水乙醇直接倒入PSI小瓶中,然后加蒸馏水,稀释为 70%乙醇浓度。兔抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体,1∶400,Pei-Freez Bioloicals产品(USA)原位末端标记(Tunel)试剂盒(ZK-8004)购自北京中杉生物技术有限公司。

1.1.4 仪器 H-7500型透射电镜,由日本日立公司生产。

1.2 方法

1.2.1 建模、分组及给药 36只 SD大鼠随机选择 8只作为空白对照,28只大鼠造模处理。应用文献〔1,2〕所介绍的 PSI皮下注射法,隔日(每周一、三、五)给予 28只大鼠背部皮下注射PSI溶液,150μl/只,连续 2 w,正常对照组大鼠给予同等量的70%乙醇溶液背部皮下注射。PD造模成功后将造模成功的大鼠随机分为三组,中药组 10只,美多巴组 10只,模型组 8只。造模 4 w后,按熄风止颤合剂 1.28 g/kg,美多巴 200 mg/kg、生理盐水 2.5 ml/d的剂量,分别灌胃给药,连续 3 w。

1.2.2 体重及行为学观察 实验期间每日观察并记录各组大鼠的体毛、梳理动作、站立次数、肢体震颤、僵直等行为,造模期间及造模结束后的 4 w内每周称重一次,给药期间及给药结束后 3 w每日称重一次。

1.2.3 标本采集 灌胃给药 3 w后,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,4%多聚甲醛溶液,灌注。迅速开颅取鼠全脑,取出黑质,放入 10%的中性甲醛中固定用于 HE染色、免疫组织化学及TUNEL检测。部分黑质切取成体积约为 1 mm3左右的组织块,立即置于戊二醛固定液中后固定用于电镜检测。

1.3 统计学分析 应用 SPSS11.5统计软件,数据以±s表示,独立样本采用t检验。

2 结 果

2.1 大鼠行为学改变 造模大鼠注射 PSI结束后,逐渐出现不自主咀嚼,站立次数、梳理动作增多;PSI注射结束后第 4周症状较明显,大鼠主要表现为采食量减少毛发粗糙无光泽、污秽,前爪出现颤抖,行走时重心明显降低,伸展姿态时腹部接触地面,运动迟缓,四肢和躯体的伸展缓慢。第五周开始治疗,美多巴治疗组在治疗 1 w后,采食量渐稳定,体重降低幅度减小,脱毛现象减轻,震颤症状略改善,步态稍稳,随着治疗时间延长震颤症状明显改善;中药治疗组,治疗约 2 w后,采食量不再减少且逐渐增加,体重稳定亦逐渐增加之后维持在较高的水平,比美多巴治疗组同期体重略增加,震颤症状明显改善,且症状改善较美多巴组更明显。

2.2 黑质多巴胺神经元的改变

2.2.1 TH免疫组织化学 阳性表达部位位于黑质致密部多巴胺神经元的胞质,细胞排列呈条带状。与空白组比较,模型组黑质致密部的多巴胺神经元数量明显减少(P﹤ 0.05),残存神经元体积大小不等,形态不规则。美多巴治疗组,黑质致密部多巴胺神经元数量空白组减少,但较模型组数量略增加。中药治疗组,黑质致密部多巴胺神经元较空白组减少,但较美多巴治疗组进一步增加,且残存神经元体积及形态与正常神经元差异较小。见图 1,表 1。

2.2.2 TUNEL检测 阳性表达部位为细胞核,呈棕黄色颗粒状。在四组动物中,模型组阳性神经元数量最多,其后依次为美多巴组,中药组,空白组。见表 1。

表1 免疫组织化学染色TH阳性细胞计数及细胞凋亡指数(±s)

表1 免疫组织化学染色TH阳性细胞计数及细胞凋亡指数(±s)

与空白组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05,3)P＜0.01

组别 n 免疫组化染色 凋亡指数(%)空白组 8 26.25±0.34 10.12±0.16模型组 8 8.12±0.151) 25.23±0.87美多巴组 10 15.36±0.832) 21.56±0.25中药组 10 22.51±0.493) 16.84±0.56

图1 各组TH免疫组化阳性表达(×400)

2.2.3 超微结构改变 模型组:电镜下可见大鼠黑质超微结构发生病理性改变,其胞膜明显内陷或不连续,胞核形状不规则,核内染色质凝集,呈斑块状,大小不等,有小的溶解灶,核仁边移细胞器结构不清,线粒体体积增大,密度降低,嵴呈不同程度的溶解,部分线粒体呈空泡样变或髓样变,高尔基复合体囊泡变,核糖体明显减少。美多巴治疗组:电镜显示黑质神经元胞质内部分线粒体有空泡样改变,嵴断裂,但少数神经元已基本上恢复到正常形态,神经元内有丰富的核糖体和发达的高尔基复合体,细胞核内出现双核仁。中药治疗组:电镜显示黑质神经元内出现大量粗面内质网,高尔基复合体发达,线粒体结构完整,嵴清晰可辨,已基本上恢复到正常形态,核染色质细颗粒状,偶见部分线粒体有空泡样改变、髓样变。

3 讨 论

PD是一种中老年人最常见的中枢神经系统变性疾病,其病理学改变表现为黑质-多巴胺能神经元退化及纹状体多巴胺水平的降低。目前,人类对于 PD的研究以动物模型为主。其中,6-羟基多巴胺模型、鱼藤酮模型、果蝇模型、α-synuclein小鼠模型、MPTP模型是最常用的几种造模方法。本实验选择了McNaught〔1〕等研究建立的应用 PSI导致进行性神经变性的慢性动物模型,离体和活体研究显示PSI可以导致多巴胺能神经元变性。给予PSI的动物逐渐出现进行性帕金森综合征,伴随有Lewy小体形成和多巴胺能细胞坏死和凋亡,与人类PD病理类型相似,能够较大程度的模拟人类 PD的发病过程。该造模方法最大的特点是慢性动物模型,体征、症状、形态学表现等更接近临床;造模过程操作简单,较目前最常用的经颅注射法极大降低了动物的死亡、感染等并发症的发生;动物模型的多巴胺能神经元病变呈进行性,行为异常和运动障碍等症状持久、不发生自行恢复。

PD的病因和发病机制目前仍未完全阐明,多数研究者认为,PD的发生与多巴胺神经元的凋亡有关。曹非等〔3,4〕通过对6-羟基多巴胺大鼠模型的研究发现,PD组中黑质细胞凋亡明显增加,且可能与促凋亡因子 Bax的高表达有关。郭明〔5〕等也通过MPTP小鼠模型研究发现,MPTP可通过其中间产物 MPP+促进黑质神经元的凋亡,而诱导 PD的发生。本实验通过免疫荧光、TUNEL等方法,发现 PSI诱导的 PD大鼠黑质神经元的凋亡细胞较正常对照组明显增多,因此 PSI诱导的 PD与细胞凋亡有关。

目前,还没有特异的根本治疗本病的方法,左旋多巴制剂自六十年代应用于临床治疗以来,一直都是临床上治疗 PD的核心药物,长期服用此药会产生诸多的副作用。近年来,中医药防治 PD取得可喜成果。其治疗主要遵从以下 4个法则:熄风止颤法、补阴法、涤痰法、活血化瘀法,其中熄风止颤法是临床应用最广泛的一种方法。本实验,用熄风止颤合剂对 PSI诱导的 PD大鼠进行治疗,发现其症状有明显改善。免疫组织化学和免疫荧光检测发现,中药组黑质多巴胺神经元数量均比模型组明显增多,由此说明熄风止颤合剂对PD有一定疗效。同时本实验还通过TUNEL法,对美多巴及熄风止颤合剂进行对照,检测发现,美多巴能够减少黑质神经元的凋亡,这一结果与何成建等〔7〕的发现是一致的,熄风止颤合剂亦能减少黑质神经元的凋亡,且凋亡的细胞数量较美多巴组进一步减少。电镜检测也提示熄风止颤合剂能够更好地改善残存黑质多巴胺神经元的超微结构,从而改善黑质多巴胺神经元的功能。

1 McNaught KS,Perl DP,Brownell AL,et al.Systemic exposure to proteasome inhibitors causes a progressive model of Parkinson′s disease〔J〕.AnnNeurol,2004;56(1):149-62.

2 刘雨清,张伟栋,李媛媛 .一种新的帕金森病动物模型〔J〕.中国实验动物学报,2007;15(2):159-60.

3 曹 非,孙圣刚,童萼塘,等 .帕金森病大鼠黑质细胞凋亡与 Bax蛋白表达相关性的研究〔J〕,中国康复,2007;22(5):298-9.

4 曹 非,骆 芳,段国安,等 .大鼠帕金森病发病过程中黑质细胞凋亡及相关基因表达〔J〕,中国老年学杂志,2007;27(24):2369-71.

5 郭 明,陈生弟,刘振国,等 .帕金森病小鼠黑质细胞凋亡的实验研究〔J〕,中华神经科杂志,1998;31(4):216-9.

6 何成建,袁灿兴,卫洪昌,等 .美多巴对帕金森病大鼠细胞凋亡的影响〔J〕,中华老年医学杂志,2004;23(7):493-6.