黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元 bcl-2、bax及 cyt-c蛋白形态学表达的影响

焦俊霞 高维娟 钱 涛 李玉明 闫凤霞 周晓春 (承德医学院病理生理学教研室,河北 承德 067000)

黄芪,为豆科植物蒙古黄芪或荚膜黄芪的干燥根,主要功效为“补气固表,利尿脱毒、排脓、敛疮生肌”,受到历代著名医学家的重视,临床应用极为广泛。黄芪注射液主要成分为多糖、皂甙、黄酮等,具有扩张微细动脉、改善微循环、增强心肌收缩力、降低血小板黏滞度和保护红细胞变形能力等功能,临床上多用于治疗心、脑血管疾病。张雅丽等〔1〕报道黄芪注射液可以抑制缺氧缺糖后复氧复糖大鼠海马神经细胞的凋亡,但其干预海马神经细胞凋亡机制,目前尚不清楚。本实验通过对原代培养的大鼠海马神经元建立缺氧缺糖/复氧复糖模型来模拟脑缺血/再灌注病理生理过程,观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元 bcl-2、bax及 cyt-c蛋白表达的影响,探讨黄芪注射液抑制神经细胞凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SD大鼠,新生 1～2 d,雌雄兼有,SPF级动物,由天津山川红实验动物科技有限公司提供,许可证号:SCXK(津)2009-001。

1.2 试剂和仪器 兔抗大鼠 NSE多克隆抗体购于武汉博士德公司;兔抗大鼠 bcl-2多克隆抗体购于美国 Chemicon公司;小鼠抗大鼠cyt-c单克隆抗体、小鼠抗大鼠bax单克隆抗体购于Santa cruz公司;多聚赖氨酸、阿糖胞苷购自美国 Sigma公司;胎牛血清、马血清由Hyclone公司生产;谷氨酰胺、胰蛋白酶购自华美生物工程公司;DMEM/F12培养基、B27由美国 Gibco公司生产;SP免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥公司;黄芪注射液由成都地奥九泓制药厂生产;其他试剂为国产分析纯。主要仪器:HERA cell 150型 CO2培养箱由德国 Heraeus公司;LEICA DMIL 090-135.001型倒置显微镜由德国 Wetzlar GmbH公司;TDL-40B离心机由上海安亭科学仪器制造厂生产。

1.3 海马神经元的培养 取新生 24 h的乳鼠放进冰浴的75%酒精内浸泡 1 min消毒并窒息,用眼科显微镊夹取海马组织,在解剖显微镜下去除含有血管的软脑膜(以上操作均在冰上进行),沉淀后吸去上层 D-Hanks液,放入 0.125%胰蛋白酶消化 10～15 min,同时用眼科剪剪切海马组织到 1 mm3大小,用马血清终止消化,把组织块混合液移入离心管,1 000 r/min离心 5 min,离心 3次,去上清后加 DMEM/F12溶液 5 ml,吹打离散组织,制成细胞悬液,200目滤网过滤。取 10μl细胞悬液苔盘蓝染色计算活细胞数,接种在直径为 22 mm培养皿中,用于细胞免疫化学。

1.4 缺氧缺糖/复氧复糖细胞模型的建立与实验分组 把原代培养 8d的大鼠海马神经元随机分为正常对照组、模型组、黄芪注射液组和黄芪注射液溶剂对照组。除正常对照组外均参照 Bossenmeyer〔2〕等的方法建立缺氧缺糖/复氧复糖细胞模型:用无糖 Earle液代替培养液,随即把培养皿(瓶)置于 37℃CO2温箱中的缺氧装置里,快速通入高纯氮气 5 min,再使气体匀速缓慢连续排出。缺氧缺糖 30 min后,换正常无血清培养液继续在 37℃,5%CO2培养箱内培养。黄芪注射液组于缺氧缺糖时加入黄芪注射液 0.5g(生药)/L〔1〕,直至培养结束;黄芪注射液溶剂对照组处理方法与黄芪注射液组相同,只是将黄芪注射液换为 pH7.4的等量黄芪注射液溶剂即无菌去离子水;模型组在缺氧缺糖时加入与正常培养液等量的 Earle′s液,缺氧缺糖后正常培养。各组在复氧复糖后 0、0.5、2、6、24、72和 120 h观察bcl-2、bax、cyt-c蛋白形态学表达变化。

1.5 免疫细胞化学检测海马神经元纯度鉴定及 bcl-2、bax、cytc蛋白表达 采用 SP法检测 NSE、bcl-2、bax及 cyt-c,具体操作均按试剂盒说明书进行。兔抗大鼠NSE多克隆抗体按 1:50稀释,兔抗大鼠 bcl-2多克隆抗体按 1∶1 500稀释、小鼠抗大鼠 bax单克隆抗体按 1∶300稀释、小鼠抗大鼠 cyt-c单克隆抗体按 1∶400稀释;PBS代替一抗作阴性对照。阳性细胞胞浆和突起呈棕黄色,胞核有少许黄色颗粒。采用 MiVnt图像分析系统对免疫组化阳性结果进行半定量分析。

2 结 果

2.1 海马神经元原代培养纯度鉴定 免疫组化染色结果显示:无血清培养 8d的海马神经元胞体饱满,突起明显、突起末端分支形成神经网络,相互支持生长,神经胶质细胞少见,5个400倍视野中阳性神经细胞的数目为 72个,纯度为(91.48±0.72)%,见图 1。

2.2 细胞免疫化学检测海马神经元 bcl-2、bax、cyt-c蛋白表达免疫组化染色结果显示:与正常对照组比,模型组除0h外其余各时间点 bcl-2、bax、cyt-c蛋白表达明显增高,而 bcl-2/bax比值降低(P＜0.05);与模型组比,黄芪注射液组除 0 h外其余各时间点 bcl-2蛋白表达及 bcl-2/bax比值增高、而 bax、cyt-c蛋白表达显著降低(P＜0.05),而黄芪注射液溶剂对照组无明显差异(P＞0.05),bcl-2蛋白在 0.5 h有表达,2 h达高峰。bax和cyt-c蛋白在 0.5h有表达,6 h达高峰。见表 1。

图1 NSE蛋白的表达(×400)

表1 黄芪注射液对缺氧缺糖 /复氧复糖大鼠海马神经细胞 bcl-2、bax、bcl-2/bax表达的影响(±s,n=5)

表1 黄芪注射液对缺氧缺糖 /复氧复糖大鼠海马神经细胞 bcl-2、bax、bcl-2/bax表达的影响(±s,n=5)

与正常对照组比较:1)P＜0.05;与模型组、溶剂对照组比较:2)P＜0.05

组别bcl-2 0 h 0.5 h 2 h 6 h 24 h 72 h 120 h正常对照组 0.368±0.04 0.352±0.04 0.371±0.02 0.366±0.05 0.370±0.03 0.358±0.04 0.349±0.02溶剂对照组 0.365±0.02 0.533±0.041) 0.625±0.041) 0.572±0.021) 0.543±0.041) 0.475±0.031) 0.386±0.041)模型组 0.370±0.03 0.536±0.041) 0.630±0.021) 0.583±0.031) 0.539±0.021) 0.486±0.051) 0.404±0.031)黄芪注射液组 0.369±0.03 0.573±0.022) 0.681±0.032) 0.631±0.052) 0.571±0.012) 0.521±0.022) 0.395±0.032)组别 bax 0 h 0.5 h 2 h 6 h 24 h 72 h 120 h正常对照组 0.433±0.04 0.413±0.04 0.452±0.02 0.422±0.05 0.448±0.03 0.437±0.06 0.408 ±0.03溶剂对照组 0.432±0.05 0.728±0.061) 0.875±0.041) 0.972±0.031) 0.810±0.021) 0.639±0.051) 0.521 ±0.041)模型组 0.430±0.06 0.730±0.041) 0.880±0.031) 0.965±0.021) 0.795±0.051) 0.644±0.061) 0.514±0.021)黄芪注射液组 0.429±0.03 0.655±0.042) 0.735±0.032) 0.802±0.042) 0.693±0.032) 0.576±0.042) 0.468±0.052)组别 bcl-2/bax 0 h 0.5 h 2 h 6 h 24 h 72 h 120 h正常对照组 0.850±0.028 0.852±0.023 0.851±0.022 0.851±0.019 0.852±0.030 0.855±0.020 0.855±0.030溶剂对照组 0.844±0.023 0.728±0.0211) 0.710±0.0241) 0.591±0.0301) 0.670±0.0201) 0.739±0.0181) 0.771±0.0261)模型组 0.858±0.021 0.730±0.0251) 0.692±0.0201) 0.611±0.0201) 0.673±0.0231) 0.744±0.0251) 0.786±0.0211)黄芪注射液组 0.852±0.025 0.814±0.0192) 0.799±0.0282) 0.758±0.0212) 0.788±0.0302) 0.803±0.0222) 0.812±0.0272)

3 讨 论

脑血管病是神经系统常见病、多发病、其致死率、致残率均高,缺血造成了脑组织的损伤,脑缺血后的再灌注损伤是缺血性脑血管病发病的重要病理生理环节,主要通过诱导细胞凋亡导致神经元死亡〔3〕。缺氧缺糖/复氧复糖所致的神经细胞损伤是脑缺血/再灌注损伤主要表现形式之一。研究表明,线粒体在真核细胞凋亡过程中起着枢纽作用,线粒体通路在神经细胞凋亡控制中发挥决定性作用〔4〕。

线粒体是有氧呼吸产生能量的主要场所,在细胞凋亡过程中起最基本的作用,其关键性分子是cyt-c,而主要的信号转导通路是 JNK信号转导通路,其中JNK3的表达与神经元凋亡关系十分密切,叶冬青〔5〕等研究表明,缺氧缺糖/复氧复糖可通过增加 JNK3表达而诱发神经元凋亡。正常情况下cyt-c是一个定位于线粒体膜间隙的水溶性蛋白,稳定地结合于线粒体内膜,参与呼吸链上的电子传递。在缺血缺氧时,线粒体膜通透性增加,大量cyt-c蛋白释放入细胞胞质,阻断呼吸链电子传递,细胞能量供应减少,最终导致细胞凋亡。cyt-c释放的具体机制有两种途径:①线粒体外膜蛋白聚合成膜通透转运孔PTP复合体,是一种高电导非选择性通道〔6〕。外界刺激使 PTP开放和线粒体膜电位崩解,水分进入导致线粒体外膜断裂cyt-c和凋亡介导因子(AIF)释放。②Bcl-2基因蛋白家族形成的通道〔7〕。Bcl-2家族成员通过调节线粒体外膜的通透性和完整性起重要调控作用,Bcl-2家族可以分为两类:一类是抗细胞凋亡基因,其代表是 Bcl-2基因;另一类是促细胞凋亡基因,其代表是 bax基因。Bcl-2/Bax镶嵌在线粒体膜上,调控凋亡诱导蛋白的释放和线粒体功能,两者间的平衡影响凋亡的发生〔8〕。线粒体外膜上的Bax能允许 cyt-c穿过线粒体膜,进入细胞质,从而引起细胞凋亡,而Bcl-2的作用正好相反,它能封闭 Bax形成孔道的活性,使一些小分子不能自由通透,从而保护细胞免于凋亡。进入胞质的 cyt-c与凋亡酶激活因子-1(APAF-1)结合并将其激活,然后又结合辅助因子 dATP/ATPAPA构成凋亡小体,其中的APAF-1招募 procaspase-9在凋亡小体上寡聚,procaspase-9发生同源活化〔9〕,其进一步激活下游的效应胱天蛋白酶 caspase-3,进而活化 caspase-6、7促细胞走向凋亡〔10〕。他们通过激活一系列下游基因发挥调节凋亡作用。

此外,有研究表明,Bcl-2是抗凋亡基因,而 Bax是促凋亡基因,二者的比例是决定细胞是否发生凋亡的重要调控因素〔11〕。在细胞中 Bcl-2蛋白和Bax蛋白是以异二聚体的形式存在,阻止 Bax插入线粒体外膜,保护线粒体电势梯度,调节细胞内Ca2+的自稳状态和氧化还原状态来抑制凋亡。如果 Bcl-2和Bax的表达量相互平衡,形成的 Bcl-2/Bax异二聚体占优势,则细胞的存活期正常;如果 Bcl-2过表达而 Bax的表达不相应增多,使形成的Bcl-2/Bcl-2同二聚体占优势,则细胞的存活期延长;如 bax过表达而 Bcl-2不相应增多,使形成的 Bax/Bax同二聚体占优势,则发生细胞凋亡〔12〕。

现代药理学研究表明,黄芪所含的黄芪皂甙类和黄芪多糖具有扩张血管、清除体内氧自由基、减少血栓形成、改善脑血流、降低血脂、改善微循环等多重作用〔13〕。黄芪注射液为中药黄芪提取物制成的针剂,具有益气养元、扶正祛邪、通脉养心、健脾利湿的作用。黄芪注射液每 1 ml相当于生药 2 g,张雅丽等〔1〕研究证实黄芪注射液可提高海马神经细胞活性,抑制缺氧缺糖后复氧复糖大鼠海马神经细胞的凋亡。

本实验以大鼠海马神经元原代培养为基础,通过对培养细胞施加缺氧缺糖/复氧复糖因素来模拟脑缺血/再灌注病理生理过程,海马神经元在缺氧缺糖后复氧复糖 0 h细胞凋亡信号转导通路还未启动,故各组 bcl-2、bax及 cyt-c蛋白表达比较无明显差异。复氧复糖 0.5 h随细胞凋亡信号的启动 bcl-2、bax及cyt-c蛋白表达开始升高。随着复氧复糖时间延长,发挥进一步凋亡信号传递过程,模型组 bcl-2、bax及 cyt-c蛋白表达进一步增高,其中 bcl-2蛋白表达 2 h达高峰、bax及 cyt-c蛋白表达 6 h达高峰,复氧复糖 24、72、120 h表达逐渐降低但仍显著高于正常组。黄芪注射液可显著降低缺氧缺糖/复氧复糖后除 0 h外各时间点 cyt-c、bax蛋白的表达,使 bcl-2蛋白表达升高。本实验显示,黄芪注射液可通过抑制 bax蛋白的表达,提高bcl-2蛋白活性,从而抑制 cyt-c蛋白释放入胞浆,发挥抗神经细胞凋亡的作用。

1 张雅丽,高维娟,闫凤霞,等 .黄芪注射液抑制缺氧缺糖后复氧复糖大鼠海马神经细胞凋亡的研究〔J〕.中国老年学杂志,2009;29(7):793-6.

2 Bossenmeyer PC,Koziel V,Daval JL.Hypoxia/reoxygenation induceapoptosis through biphasic induction of protein synthesis in cultured rat brain neurons〔J〕.Neuroscience,2000;95(4):1157-65.

3 Gross A.BCL2 proteins:regulators of the mitochondrial apoptotic program〔J〕.IUBMB Life,2001;52(3-5):231-6.

4 Jeong SY,Seol DW.The role of mitochondria in apoptosis〔J〕.BMB Rep,2008;41:11-22.

5 叶冬青,高维娟,钱 涛,等 .黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元 JNK3的表达〔J〕.中国药理学通报,2010;26(1):77-82.

6 Sayeed I,Parvez S,Wali B,et al.Direct inhibition of the mitochondrial permeability transition pore:a possible mechanism for better neuroprotective effects of allopregnanolone over progesterone〔J〕.Brain Res,2009;1263:165-73.

7 Zhang H,Li Q,Li Z,et al.The protection of Bcl-2 overexpression on rat cortical neuronal injury caused by analogousischemia/reperfusion in vitro〔J〕.Neurosci Res,2008;62(2):140-6.

8 Burguillos MA,Hajji N,Englund E,et al.Apoptosis-inducing factor mediates dopaminergic cell death in response to LPS-induced inflammatory stimulus Evidence in Parkinson′s disease patients〔J〕.Neurobiol Dis,2010;9(17):1-12.

9 Tan KO,Fu NY,Sukumaran SK,et al.MAP-1 is a mitochondrial effector of Bax〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA,2005;102(41):14623-28.

10 Tang W,Wang W,Zhang Y,et al.Tumour necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)-induced chemokine release in both TRAIL-resistant and TRAIL-sensitive cells via nuclear factor kappa B〔J〕.FEBS,2009;276(2):581-93.

11 Lin HH,ChenJH,Huang CC,et al.Apoptotic effect of 3,4-dihydroxybenzoic acid on human gastric carcinoma cells involving JNK/p38MAPK signaling activation〔J〕.Int J Cancer,2007;120(11):2306-16.

12 Tomasin R,Cintra Gomes-Marcondes MC.Oral administration of Aloe vera and honey reduces walker tumour growth by decreasing cell proliferation and increasing apoptosis in tumour tissue〔J〕.Phytother Res,2010;9(14):25-46.

13 Iijima T,Mishima T,Akagawa K,et al.Neuroprotective effect of propofol on necrosis and apoptosis following oxygen-glucose deprivation-relationship between mitochondrial membrane potential and mode of death〔J〕.Brain Res,2006;1099(1):25-32.