辛伐他汀对铜和高胆固醇阿尔茨海默病家兔海马淀粉样肽前蛋白 mRNA表达的影响

张瑞峰 马东明 姜希娟 卢 斌 苏金玲 郭茂娟

(天津中医药大学病理教研室,实验教学部,天津 300193)

近年逐渐认识到胆固醇是引起阿尔茨海默病(AD)发病的一个确定的危险因素,高胆固醇人群中,AD的发生率增高〔1〕。Mori等发现无论是AD病人脑内还是淀粉样肽前蛋白(APP)转基因小鼠脑内均在老年斑的高密度核区有胆固醇沉积〔2〕。研究还发现,脑内铜的代谢水平与 AD的发生发展密切相关,AD患者脑内老年斑块中心及周围铜的水平明显高于正常大脑组织的生理水平〔3〕。Sparks发现高胆固醇饮食家兔在饮用添加微量铜离子的蒸馏水时,AD的形态和病理表现更突出〔4〕。他汀类药物在降低血清胆固醇的同时,能使 AD的患病率降低 60% ～70%〔5〕。本研究就他汀类降低 AD发病的潜在机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 辛伐他汀(商品名:赛夫丁),南通华山药业有限公司,批号:081202。胆固醇,分析纯,天津市英博生化试剂有限公司,批号:090423;Trizol·Reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA)试剂盒、Oligod(T)16,High capacity cDNA Reverse Transcription Kit试剂盒 (Applied Biosystems、P/N:4368814),Power SYBR·Green PCR Master Mix试剂盒(Applied Biosystems、P/N:4367659)、PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司提供)。标准胆固醇(HPLC级)为美国 Sigma公司产品,色谱纯级乙腈、异丙醇、无水乙醇等。

1.2 主要仪器 HYBAIDPE 480反转录仪,ABI7300实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)仪,VAR IAN Prostar 210高效液相色谱仪(美国 VAR IAN公司生产),配置 Prostar 210高压泵、VAR IANProstar 500柱温箱、手动进样器,超速低温离心机,微量组织匀浆器,0.45μm的微孔滤器等。

1.3 方法

1.3.1 实验动物模型的建立与分组 健康成年雄性新西兰大白兔(军事医学科学院实验动物中心提供)27只,体质量(2 356±212)g,在温度(28±2)℃,湿度 37% ～48%,12h交替照明的清洁环境中给予普通饲料和自来水适应喂养 2w后,随机取出 9只作为对照组,采用普通饲料和蒸馏水喂养,直至实验结束,共 9w。其余家兔参照 Sparks等〔4〕的方法给予 2%高胆固醇饲料和含 0.12×10-6铜离子(以硫酸铜的形式)的蒸馏水造模。6 w后,造模家兔死亡 1只,将造模成功家兔随机分为模型组(由于停用胆固醇后,家兔血清胆固醇水平会很快降低,因此,6 w后继续给予高胆固醇饲养 3 w,n=9)和辛伐他汀组〔辛伐他汀(5mg◦kg-1◦d-1)灌胃 3 w,其余处理同模型组,n=8〕。上述给药剂量为“按照成人体表面积折算的等效剂量”。

1.3.2 标本获取与处理 戊巴比妥钠(25 mg/kg)静脉麻醉后,开颅于一侧海马相同位置取 100 mg大小的组织块,液氮保存备RT-PCR用。另取少量海马组织称重后按 10 ml/g加无水乙醇在冰台上磨成匀浆,在 20 600 r/min,4℃离心 2次,每次20 min,将上清液以 0.45μm的微孔滤膜滤过,取滤液分装,-70℃保存留测海马胆固醇。

1.3.3 检测项目 高效液相色谱法(HPLC)测定海马胆固醇含量。RT-PCR法测定海马APP mRNA表达。用Trizol试剂盒抽提海马组织总 RNA,采用紫外分光光度计定量并检测 RNA纯度。按逆转录试剂盒要求将总 RNA逆转录成cDNA。特异性引物序列见下表,由上海生工生物工程技术公司合成。GAPDH,正义链:5'TCTCTCAAgATTgTCAgCAACg3',反义链:5'CTTCACAAAgTggTCATTgAgg3';APP,正义链:5'TCTACCCTgAACTg-CAg3',反义链 :5'CTgCATgTCTCTTTggC3'。

1.4 统计学分析 采用SPSS16.0统计软件进行分析,数据以±s表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用 LSD法;相关性分析采用 Pearson法。

2 结 果

模型组海马胆固醇含量及APP mRNA表达水平显著高于正常组 (P＜0.05)。辛伐他汀组海马胆固醇含量及 APP mRNA表达水平显著低于模型组 (P＜0.05);与正常组相比,无显著性差别 (P＞0.05)。相关性分析显示,海马 APP mRNA表达水平与海马胆固醇含量呈正相关 (r=0.058,P＜0.05)。见表 1。

表1 辛伐他汀对海马胆固醇以及海马APPm RNA表达的影响(±s)

表1 辛伐他汀对海马胆固醇以及海马APPm RNA表达的影响(±s)

与模型组相比:1)P＜0.05

组别 n APP 海马胆固醇(mg/g)正常组 9 0.22±0.061) 1.39±0.111)模型组 9 0.47±0.12 1.51±0.07辛伐他汀组 8 0.29±0.051) 1.31±0.131)

3 讨 论

APP是广泛存在于全身组织细胞的跨膜糖蛋白。体内APP代谢途径主要有二:①结构性分泌途径即由α分泌酶水解产生 αAPPs②淀粉样肽源途径,即先后经产生 β-,γ-分泌酶水解产生 39-43个氨基酸的有神经毒性的多肽,即 Aβ。本文结果显示海马 APP的表达与海马胆固醇含量呈正相关。Frears的研究认为胆固醇负荷增强了细胞膜APP产生过程〔6〕。与本实验结果一致。APP和 Aβ易出现在生物膜上胆固醇丰富区(CRDs)。机制可能是,胆固醇通过直接影响APP的代谢而促进 Aβ生成。APP代谢途径的两个关键酶:γ和 β分泌酶的功能依赖于细胞膜的脂筏结构。脂筏是指那些富含胆固醇和鞘糖脂的膜区域,是许多蛋白质系统的信号平台。已经有足够的证据表明,高胆固醇含量的脂筏环境,可通过对 β分泌酶糖基磷酸化而显著提升其活性。胆固醇还引起 APP的β切割位点的变化,并使其处于合适的反应构象,从而促进了APP的淀粉样代谢途径,产生更多的Aβ。也有研究认为,胆固醇失衡促进β分泌酶抑制 α分泌酶对APP的裂解作用,促进了Aβ产生,进而也增加了 Aβ的聚集〔7〕。辛伐他汀降低 AD发病,可能一方面通过在转录水平上减少APP的生成,一方面通过降低脑内胆固醇含量影响脂筏形成而减少APP生成Aβ的量。

1 Kivipelto M,Helkala EL,Laakso MP,et al.Midlife vascular risk factors and Alzheimer's disease in later life:longitudinal,population based study〔J〕.BMJ,2001;322(7300):1447-51.

2 Mori T,Paris D,Town T,et al.Cholesterol accumulates in senile plaques of Alzheimer′s disease patients and in transgenic APP(SW)mice〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol,2001;60(8):778-85.

3 Lovell MA,Robertson JD,Teesdale WJ,et al.Copper iron and zinc in Alzheimer's disease senile plaques〔J〕.J Neurol Sci,1998;158(1):47-52.

4 Sparks DL,Schreurs BG.Trace amounts of copper in water induce betaamyloid plaques and learning deficits in arabbit model of Alzheimer's disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA,2003;100(19):11065-9.

5 Wolozin B,Kellman W,Ruosseau P,et al.Decreased prevalence of Alzheimer disease associated with 3-hydroxy-3-methyglutaryl coenzyme a reductase inhibitors〔J〕.Arch Neurol,2000;57(10):1439-43.

6 Frears ER,Stephens DJ,Walters CE,et al.The role of cholesterol in the biosynthesis of beta-amyloid〔J〕.Neuroreport,1999;10(8):1699-705.

7 郝俊巍,李 林.胆固醇代谢异常与阿尔茨海默病〔J〕.生理科学进展,2005;36(1):64-7.