二苯乙烯苷对血管性痴呆大鼠行为学及脑海马自由基代谢的影响

马海涵 邵 阳 陈力学 杨期东 (解放军第一五三医院神经内科,河南 郑州 45004)

血管性痴呆(VD)是因脑血管病所致的智能及认知障碍,为老年人常见病、多发病。二苯乙烯苷(2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)是传统抗衰老中药何首乌的主要药效成分之一〔1,2〕。本研究采用血管夹闭法(4-VO法)复制VD大鼠血管性痴呆模型,观察 TSG对 VD模型大鼠行为学及自由基代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 TSG(本室自制,HPLC测定纯度为 90%);丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 健康 SD大鼠 30只,3～4月龄,雄性,体重 200～250 g,由重庆医科大学实验动物中心提供。实验分为假伤组(Sham组)、VD模型组(VD组)、VD模型后TSG处理组(TSG+VD组)。动物模型制备采用 4-VO法建立 VD大鼠模型。模型成功后 TSG组灌胃 TSG 60mg◦kg-1◦d-1,5d/w,连续 4 w,sham组与 VD组均灌胃等容量生理盐水;造模共 6 w后,开始测定。

1.2.2 模型的建立 采用大鼠 4-VO法制成 VD大鼠模型:将大鼠用 10%的水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉后,仰卧固定于手术台上;常规消毒,颈正中切口,分离双侧颈总动脉。用4号丝线结扎。拉紧丝线,同时在距尾尖 1 cm处剪断放血约0.3ml,热凝止血。阻断血流 20 min,松开丝扣再灌注 10 min后,再次阻断血流 20 min,第 2次再灌后观察 30 min,缝合皮肤,切口局部注射庆大霉素 0.2万 U。对照组只分离颈总动脉,穿线但不结扎,尾部不放血。

1.2.3 行为学检测 采用Morris水迷宫法进行大鼠记忆功能的测定。Morris水迷宫由中国医学科学院生产,为一不锈钢的圆形水池,直径 150cm,高 50 cm。池壁标明 4个入水点,由此将水池等分为 4个象限,任选其中 1个象限,正中放置 1个直径 4 cm、高 29 cm的平台。测试程序为定位航行试验(place navigation):历时 5d,每日上、下午各 2次,将大鼠面向池壁分别从 4个入水点放入水中,记录其在 3 min内寻找到并爬上平台的时间即逃避潜伏期。分别在术后 1、2、3、4月重新进行水迷宫实验,大鼠每次在 3 min内寻找到并爬上平台的时间为大鼠的记忆成绩,每日 2次,连续 5 d,计算平均成绩。

1.2.4 海马组织SOD、MDA测定 测定将大鼠迅速断头、取脑,放人预先冰冷的生理盐水中,去除脑膜和血管,分出海马,称重后冰盘上匀浆,3 500r/min离心 10 min提取上清,用黄嘌呤氧化酶法测定海马组织 SOD活性,用硫代巴比妥酸法测定海马组织 MDA含量,并用蛋白含量校正。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行分析,数据资料以±s表示,采用方差分析和 q检验。

2 结 果

2.1 大鼠行为学变化 与sham组比较,VD模型组的游全程时间逐渐延长,错误次数逐渐增加,差异显著(均 P＜0.01)。与模型组比较,TSG+VD组学习成绩和记忆成绩均有显著提高(均P＜0.01)。表明 TSG有提高学习记忆能力的作用。见表 1。

表1 TSG对VD大鼠水迷宫学习成绩影响(±s,n=10)

表1 TSG对VD大鼠水迷宫学习成绩影响(±s,n=10)

与 VD组比较:1)P＜0.05,2)P＜0.01;与 sham组比较:3)P＜0.01;下表同

组别 1个月 2个月 3个月 4个月sham组 25.34±6.57 24.78±6.57 24.82±6.72 24.64±7.15 VD组 79.24±9.323)70.63±8.413)71.36±8.543)63.08±9.123)TSG+VD组 54.32±7.361)50.46±6.721)45.38±7.012)41.22±5.94

2.2 大鼠脑海马SOD活性和MDA含量 与sham组比较,VD模型组大鼠海马组织SOD活性明显降低,MDA含量明显升高(均P＜0.01);与模型组比较,TSG+VD组 SOD活性明显升高,MDA含量明显降低(P＜0.05或 P＜0.01)。见表 2。

2.3 大鼠脑海马病理学改变 与sham组比较,VD模型组鼠海马可见大量空泡样结构,神经元数目减少,核萎缩。与VD组比较,TSG+VD组空泡样结构减少,神经元数目明显增多,核萎缩较少。见图 1。

表2 TSG对 VD大鼠脑海马SOD活性和MDA含量影响(±s,n=10)

表2 TSG对 VD大鼠脑海马SOD活性和MDA含量影响(±s,n=10)

组别 SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)sham组 63.38±7.25 1.18±0.16 VD组 46.34±7.113) 1.39±0.223)TSG+VD组 57.64±6.522) 1.24±0.151)

图1 TSG对VD大鼠海马组织影响(HE,×400)

3 讨 论

VD是指各种脑血管病引起脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征。一次或多次脑梗死造成的脑组织损害导致脑功能不全,是VD发生的主要原因。由于脑组织反复缺血,导致海马、基底神经结及皮层等结构产生不可逆性损伤,随之出现痴呆症状。

临床认为,氧化损伤是导致 VD的重要病理因素,脑缺血发生后,缺血缺氧的脑组织通过黄嘌呤氧化酶系统、花生四烯酸-环氧酶系统及线粒体等途径产生大量自由基,由于脑组织生物膜中含有大量的多聚不饱和脂肪酸,因此脑对自由基损害尤为敏感。自由基可攻击血管内皮细胞和平滑肌细胞,引起血管扩张,管壁肿胀,血脑屏障破坏,通透性增加,加重脑水肿的形成和发展;自由基还可损害神经元等富含脂质的脑细胞,使多聚不饱和脂肪酸发生过氧化反应,诱导酶丧失活性,神经元死亡或凋亡,因此自由基的毒性作用已被认为脑缺血损害导致VD的关键性病理环节之一。何首乌为治疗VD使用频率最高的前几位中药之一,TSG为多羟基酚类化合物,是何首乌主要成分之一。研究表明 ,TSG能够抑制生物膜脂质的过氧化,提高机体 SOD的活性,从而抑制机体氧应激状态的产生,对VD模型大鼠在学习和记忆能力等行为学以及自由基代谢的产生影响〔3,4〕。本研究提示 TSG能够促进自由基代谢,改善 VD大鼠学习与记忆能力。

1 Ryu G,Ju JH,Park YJ,et al.The radical scavenging effects of stilbene glucosides from Polygonum multiflorum〔J〕.Arch Pharm Res,2002;25(5):636-9.

2 Um MY,Choi WH,Aan JY,et al.Protective effect of Polygonum multiflorum Thunb on amyloid beta-peptide 25-35 induced cognitive deficits in mice〔J〕.J Ethnopharmacol,2006;104(1-2):144-8.

3 Zhang L,Xing Y,Ye CF,et al.Learning-memory deficit with aging in APP transgenic mice of Alzheimer's disease and intervention by using tetrahydroxystilbene glucoside〔J〕.Behav Brain Res,2006;173(2):246-54.

4 Liu QL,Xiao JH,Ma R,et al.Effect of 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside on lipoprotein oxidation and proliferation of coronary arterial smooth cells〔J〕.JAsian Nat Prod Res,2007;9(6-8):689-97.