声动力化学疗法对大鼠脑胶质瘤凋亡及相关基因表达的影响

宋大勇 岳 武 尹立春 林述凯 王 雷 李建华

(北华大学附属医院神经外一科,吉林 吉林 132011)

声动力化学疗法(sonodynamic therapy,SDT)是一种肿瘤治疗的新方法,对体外大鼠 C6胶质瘤细胞有明显杀伤作用〔1〕,为观察 SDT对大鼠脑胶质瘤的生物学效应,本文以大鼠颅内C6胶质瘤为模型,观察SDT处理后大鼠脑胶质瘤的形态学、凋亡检测及相关基因表达的变化,以完善SDT抗胶质瘤理论。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 大鼠 C6胶质瘤细胞(哈尔滨医科大学神经外科研究所)、Wistar大鼠(哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心)、血卟啉单甲醚(HMME,北京英发康美技术开发有限公司)、胎牛血清(天津 TBD公司)、RPMI1640培养液 (美国 Hylone公司)、胰蛋白酶(美国 AMRESCO公司)、TUNEL凋亡检测试剂盒(宝灵曼公司)、兔抗鼠 Cyt-C、Caspase-3免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、山羊抗兔 IgG免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物制品有限公司)、SABC试剂盒通用型(Zymed公司)、DAB显色剂(北京中杉金桥生物制品有限公司)。

1.2 仪器 单纯照射天使多功能治疗仪(天使科技控股有限公司)、大鼠脑立体定向仪(上海江湾Ⅱ型)、MIR机(日本东芝公司 1.5TVISRT型)、倒置相差显微镜(日本 Olymp单纯照射公司 IX 70型)、CO2培养箱(上海 Herae单纯照射公司 BB 5060型)、洁净操作台(上海力申科学仪器有限公司 Hfsate1200型)、离心机(上海安亭科学仪器厂 80-2B型)。

1.3 C6胶质瘤细胞培养 C6胶质瘤细胞接种于含 10%胎牛血清的 RPMI1640完全培养液 25 ml培养瓶中,将培养瓶置于37℃、5%CO2和 95%空气的培养箱中常规培养,待细胞处于对数生长期时实验。

1.4 大鼠C6脑胶质瘤模型的制作 Wistar大鼠(雄性,体重250～350 g)96只。术前 12 h禁食、禁水,1%戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉后,固定于江湾Ⅱ型立体定向仪上,常规方法制作大鼠颅内 C6脑胶质瘤模型〔2〕。术后连续 3 d注射青霉素 4万U/d,常规饲养。

1.5 实验分组 大鼠接种C6胶质瘤术后 14 d,经MIR扫描,待肿瘤直径达 3～5mm随机分成 4组:SDT组(1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后,尾静脉注射 HMME10 mg/kg,2 h后 1.0 mHz频率、0.5 W/cm2光强度、120 s照射)、单纯照射组、单用HMME组(尾静脉注射 HMME10 mg/kg)和未处理的对照组,每组 24只。大鼠避光 7 d,常规饲养。

1.6 原位凋亡检测和Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达水平观察4组大鼠处理后 24 h、3,7d分别随机处死 8只,开颅取出肿瘤组织。标本常规固定、包埋、切片。①TUNNEL法检测细胞凋亡情况,方法按照Roche公司原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作,常规封片,显微镜下观察。结果判定是以核阳性为判定标准,并结合 HE染色 40倍显微镜下观察,对 HE染色证实为坏死的细胞不计数。细胞核内的棕褐色染色为阳性细胞,400倍显微镜下每张切片随机选择5个视野,两人双盲计数 500个细胞中的阳性细胞数,取均值。排除有严重的炎症反应和坏死灶的区域,因为这给单个凋亡细胞的鉴别带来困难。计算凋亡细胞百分率:凋亡细胞百分率(%)=阳性细胞数/(阳性细胞数 +阴性细胞数)×100%。②标本免疫组织化学染色采用SABC法,按说明书进行操作,常规封片,显微镜下观察。Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达结果判定:每张切片 400倍显微镜观察,随机选择 5个视野,两人双盲计数 500个细胞中的阳性细胞数(细胞胞浆内棕褐色染色),取均值。计算蛋白表达百分率,蛋白表达百分率(%)=阳性细胞数/(阳性细胞数 +阴性细胞数)×100%。对四组各时间点Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达率分别与凋亡率计算 Pearson相关系数(r值)。

2 结 果

2.1 一般状态 在实验过程中因操作不慎死亡或种瘤失败的大鼠予以重新补充。大鼠接种后均无感染,从接种后第 3天开始,部分大鼠逐渐出现消瘦、肢活动不灵活、抽搐、易激惹等表现,濒死前 4组均表现频发抽搐、极度消瘦、恶病质等症状。

2.2 组织学检查结果 处理前胶质瘤细胞均具有异形性特征,瘤组织内有新生血管形成,肿瘤组织与脑组织无明显分界。SDT组处理后 24 h肿瘤组织不规则片状坏死,坏死区中心部分无细胞结构,碎裂、固缩的胶质瘤细胞大量分布于坏死区向正常肿瘤组织过渡的交界区;单纯照射组处理后 24h肿瘤组织出现小片状坏死区,期间散在点状坏死细胞,亦多分布于坏死区向正常肿瘤组织过渡的交界区(图 1)。SDT组处理后 3 d肿瘤组织不规则片状坏死区面积较24 h时明显减小,坏死区内仍可见较多碎裂、固缩胶质瘤细胞;单纯照射组处理后3d肿瘤组织内偶见点状坏死细胞。SDT组与单纯照射组处理后 7 d时胶质瘤组织形态同对照组及HMME组,未见坏死、碎裂的细胞。

图1 SDT组和单纯照射组HE染色处理后 24 h组织学结果(×40)

2.3 原位凋亡检测结果 HMME组和对照组凋亡细胞极少,各时间点凋亡率比较,无统计学意义(表 1)。切片均未见明显坏死细胞,偶见凋亡细胞。单纯照射组处理后 24 h,切片可见小片状坏死区和散在分布的坏死细胞,凋亡细胞散在分布,凋亡率明显高于 HMME组和对照组(P＜0.01);处理后 3 d切片可见散在坏死细胞,偶见凋亡细胞,凋亡率较处理后24h下降,与 HMME组和对照组比较,无统计学意义;处理后 7 d,切片未见明显坏死细胞,偶见凋亡细胞,凋亡率与 HMME组和对照组比较,无统计学意义。SDT组处理后 24 h,切片可见明显片状坏死区或坏死细胞,凋亡细胞多分布于片状坏死区周边,或与坏死细胞夹杂,凋亡率明显高于其他 3组(P＜0.01)(图 2);处理后 3 d,切片见片状坏死区明显缩小、坏死细胞数量明显减少,凋亡细胞少见,但凋亡率与其他 3组比较差异显著(P＜0.01);处理后 7d,切片未见坏死细胞,凋亡细胞偶见,凋亡率与其他 3组比较,无统计学意义。

图2 单纯照射组和SDT组原位凋亡检测处理后 24 h(×400)

2.4 Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达结果 HMME组和对照组 Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达阳性细胞偶见,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达率各时间点比较,无统计学意义。切片均未见明显坏死细胞。单纯照射组处理后24 h,切片可见小片状坏死区和散在分布的坏死细胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达阳性细胞多分布于小片状坏死区周边,或与坏死细胞夹杂,表达率高于 HMME组和对照组(P＜0.01);处理后 3 d切片可见散在坏死细胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达阳性细胞偶见,多与坏死细胞夹杂或分布其周边,但表达率较处理后 24h明显下降,与 HMME组和对照组比较,无统计学意义;处理后 7 d,切片未见明显坏死细胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达阳性细胞偶见,蛋白表达率与 HMME组和对照组近似,无统计学意义。SDT组处理后 24 h,切片可见明显片状坏死区或坏死细胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达阳性细胞多分布于片状坏死区、坏死细胞周边或夹杂其中,蛋白表达率明显高于其他 3组(P＜0.01);处理后 3d,切片见片状坏死区明显缩小、坏死细胞数量明显减少,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达阳性细胞多分布于片状坏死区或坏死细胞周边,数量也明显减少,但 Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达率与其他 3组比较差异显著(P＜0.01);处理后 7d,切片未见明显坏死细胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表达阳性细胞偶见,蛋白表达率与HMME组和对照组近似,无统计学意义(表 1和图 3)。

表1 各组大鼠不同时间点凋亡率、Cyt-C和Caspase-3蛋白表达率的比较(±s,%,n=8)

表1 各组大鼠不同时间点凋亡率、Cyt-C和Caspase-3蛋白表达率的比较(±s,%,n=8)

与 SDT组比较:1)P＜0.01;与对照组比较:2)P＜0.01

组别 凋亡率24 h 3 d 7 d Cyt-C蛋白24h 3 d 7 d Caspase-3蛋白24 h 3 d 7 d SDT组 25.10±0.822) 1.23±0.542) 0.23±0.23 36.18±1.382) 1.95±0.502) 0.08±0.10 30.18±1.102) 1.43±0.702) 0.05±0.09单纯照射组 6.28±0.681)2) 0.35±0.401) 0.13±0.28 5.90±1.081)2) 0.18±0.231) 0.10±0.19 5.18±0.771)2) 0.08±0.101) 0.00±0.00 HMME组 0.30±0.301) 0.18±0.231) 0.28±0.51 0.20±0.261) 0.08±0.151) 0.03±0.07 0.05±0.091) 0.03±0.071) 0.05±0.14对照组 0.43±0.381) 0.38±0.361) 0.23±0.29 0.08±0.101) 0.10±0.111) 0.08±0.15 0.08±0.151) 0.10±0.111) 0.03±0.07

图3 SDT组和单纯照射组处理后 24 h Cyt-C和 Caspase-3蛋白表达(×400)

2.5 SDT组 Cyt-C和Caspase-3蛋白表达率与凋亡率的相关性分析 Cyt-C蛋白和 Caspase-3蛋白表达率与凋亡率呈正相关(均为 r=0.99,P＜0.01)。

3 讨 论

研究表明,化疗、放疗、基因治疗、光动力疗法(PDT)等均可促进胶质瘤细胞的凋亡过程,提高疗效,延长患者的生存期。研究已经证实 SDT可引起体外 C6胶质瘤细胞凋亡〔1〕,因此凋亡也是 SDT杀伤C6胶质瘤细胞的方式之一。通过组织学及原位凋亡检查,发现大鼠颅内胶质瘤SDT处理后早期(24h)肿瘤组织坏死及凋亡均达到高峰,随后坏死及凋亡的瘤组织均逐渐减少,至处理后 7 d时肿瘤组织中已见不到坏死及凋亡的瘤细胞,这表明:①胶质瘤组织坏死和凋亡时间变化规律基本吻合,也表明凋亡是 SDT杀伤胶质瘤的重要方式;②SDT处理大鼠颅内胶质瘤,24 h达到作用高峰,提示SDT如应用于临床,使用的时间间隔为 24h左右;③凋亡高峰出现于处理后早期(24 h),但凋亡时间较体外(6 h)略后移,这可能因为单纯照射作用于体外细胞时衰减低,而作用于颅脑组织中衰减增强,较低的声强度启动细胞凋亡时间较长有关;④24 h后细胞凋亡明显减少,处理后 7d,4组凋亡率已无统计学意义,表明 SDT仅处理后24 h内对细胞凋亡存在明显影响,而中远期则无影响。

单纯照射处理后也可引起胶质瘤坏死及凋亡,其高峰同样发生在早期(24 h),但肿瘤坏死面积及凋亡率明显较 SDT低,提示:①单用单纯照射有较弱的抗胶质瘤效应;②凋亡也是单纯照射杀伤体内胶质瘤的方式之一。单用HMME未显示出抗胶质瘤效应,对细胞凋亡无影响。通过与单纯照射组、HMME组及对照组比较,表明 SDT的杀伤胶质瘤效应并非简单的单纯照射+HMME效应,而是二者结合发生一系列声化学反应,激活声敏剂分子,通过增效声动力效应杀伤肿瘤细胞。刘全宏等〔3〕提出SDT诱导肿瘤细胞凋亡的途径有可能依赖于线粒体结构损伤后释放 Cyto-C等蛋白,激活 Caspase家族蛋白,从而导致细胞凋亡。其中caspase-3作为关键蛋白酶,是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必由之路〔4〕。本结果表明 SDT处理后早期出现细胞凋亡可能是损伤线粒体后,释放Cyto-C,激活Caspase家族蛋白,经过一系列细胞凋亡蛋白酶级联反应,活化了关键蛋白酶caspase-3引起的。单纯照射处理后早期(24 h)也出现 Cyto-C、Caspase-3蛋白较强的表达,说明单纯照射诱导细胞凋亡可能也与线粒体结构损伤后释放 Cyto-C等蛋白,激活 Caspase-3有关。单用 HMME未出现 Cyto-C、Caspase-3蛋白的表达,同样未启动凋亡。

综上,SDT对大鼠脑胶质瘤有明显的抑制效应,早期可能通过损伤线粒体后,释放 Cyto-C,激活 Caspase-3,直接启动胶质瘤细胞本身凋亡程序,诱导大鼠脑胶质瘤细胞凋亡。

1 宋大勇,岳 武,赵 钊,等.声动力化学疗法对体外C6胶质瘤细胞作用的研究〔J〕.中华神经外科杂志,2007;23(2):107-10.

2 刘 斌,金必连,李 龄 .激光间质内热疗联合顺铂治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究〔J〕.中国激光医学杂志,2001;10(2):74-7.

3 刘全宏,王 攀,李 萌,等 .声化学激活血卟啉诱导艾氏腹水肿瘤细胞凋亡〔J〕.动物学报,2003;49(7):620-8.

4 李小明,孙志贤 .细胞凋亡中的关键蛋白酶-Caspase-3〔J〕.国外医学◦分子生物学分册,1999;21(1):6-9.〔2010-09-11收稿 2010-12-19修回〕