EGCG对恶性胶质瘤细胞MMP-9表达及活性的影响

阳文任 梁庆模

多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme，GBM）是常见的中枢神经系统恶性神经上皮细胞肿瘤，占脑癌病例中一半以上。在世界范围内，每年诊断出的此类病例大约有175，000人，大多数癌症通过癌细胞扩散全身而导致死亡[1]。肿瘤细胞的侵袭和转移是脑胶质瘤最重要的生物学行为，其中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类降解结缔组织细胞外基质降解过程中必不可少的酶，几乎能降解细胞外基质的所有成分。在肿瘤的转移过程中起重要作用[2]。本研究试图探讨绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在人星形神经胶质瘤细胞系中，对佛波脂诱导的MMP-9表达有何影响，从而丰富EGCG的药理作用。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

星形神经胶质瘤细胞系U87MG购自中国典型培养物保存中心（武汉）。Wizard DNA纯化试剂盒为Promege 产品；DNA胶回收试剂盒购自北京博大泰克公司。DNA Marker DL15,000购自大连TaKara生物工程公司、100bp DNALadder购自北京钧尧伟业生物技术公司；氨苄青霉素、链霉素购自华美公司。其余试剂主要购自上海生工生物工程公司和江苏碧云天等公司。

1.2 神经胶质瘤细胞系U87MG的培养与EGCG处理

星形神经胶质瘤细胞系U87MG于无抗生素的含10% FBS的DMEM培养基，37℃、5% CO2的培养箱中培养。取U87MG传代30～36h处于对数生长期的细胞(约70%～80%融合)，以每孔0.5×105细胞平均接种于6孔细胞培养板中，每孔体积1ml，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的环境中培养过夜，同时按实验要求加入不同浓度(0、5、10、20μM)的EGCG，另每孔加100ng/ml的PMA。37℃，5% CO2条件下培养48h后，收集细胞和上清液。

1.3 明胶酶谱实验

条件培养液经含2mg/ml明胶A和明胶B的聚丙烯酰胺凝胶（8%）中电泳。电泳结束后，凝胶置于含2.5%的 Triton X-100中振荡洗脱3次，每次30min以去除SDS。然后将凝胶放入100 mL孵育液（100mM Tris-HCl，10mM CaCl2）37℃中孵育24h，经染色(0.5%考马斯亮蓝)、脱色后，用凝胶成像系统拍照。

1.4 免疫印迹

细胞处理结束后，采用总蛋白提取试剂盒提全细胞蛋白。用BCA方法定量后，100℃煮沸5min，取20μl蛋白用于SDSPAGE。电泳结束后，用半干转印法转膜，洗膜结束后用MMP-9多克隆抗体（Santa Cruz）孵育，洗膜，孵育二抗，ECL化学发光显影。同时采用β-actin抗体作为内参。

1.5 RT-PCR

细胞处理结束后，用Trizol试剂提取总RNA。使用AMV 逆转录酶和随机引物9聚体合成第一链cDNA。反应条件如下：94℃预变性5min，随后95℃ 30s,60℃ 45s,72℃ for 30s。共30循环，最后在72℃下延伸7min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳并经凝胶成象系统成像。

2 结果

2.1 EGCG对PMA诱导MMP-9基因转录的影响

RT-PCR结果显示，EGCG处理后，与对照组相比，MMP-9基因mRNA水平随EGCG浓度的增高而降低（图1A）。内参在所有时间段保持恒定（图3B）。

图1 EGCG对U87MG细胞中MMP-9基因转录的影响

2.2 EGCG对MMP-9蛋白表达的影响

Western blot证实，表明EGCG能抑制U87MG细胞MMP-9蛋白的表达，并随着EGCG浓度的增加，其表达水平逐渐降低（图2A）。β-actin在所有组中无明显影响(图2B)。

图2 EGCG对U87MG细胞中MMP-9表达的影响

2.3 EGCG对PMA诱导MMP-9的酶活性的改变情况

取U87MG细胞与EGCG共孵育48h后的培养上清，以明胶为底物，酶谱检测MMPs的表达及活性(见图3)，表明EGCG能抑制PMA诱导的RU87MG细胞MMP-9的活性，且随着EGCG浓度的增加，U87MG细胞MMP-9的酶活性减弱越明显。

图3 EGCG对PMA诱导RU87MG细胞MMP-9的酶活性影响

3 讨论

胶质母细胞瘤是脑原发肿瘤中发病率最高、治愈率最低、治疗效果最差的一类肿瘤。可发生于任何年龄，以成人多见。原发性脑胶质瘤的5年生产率约为20%，儿童期肿瘤的5年生存率预期为72%，主要是因为GBM等恶性胶质瘤的预后较差。在成年人，GBM 2年平均生存率只有10%～25%。GBM呈浸润性生长，病程迅速进展，手术切除后常很快复发。恶性肿瘤病人治疗失败和致死的主要原因就是肿瘤的侵袭和转移[3]。在已知的恶性肿瘤中，除皮肤基底细胞癌、某些中枢神经系统肿瘤极少发生转移外，其他绝大多数肿瘤在疾病的进展过程中都可以发生转移。而肿瘤的侵袭和转移是一个多阶段的过程，包括肿瘤细胞与细胞外基质(ECM)成分特异性粘附、降解ECM以及降解区域趋化因子的释放等。其中，肿瘤细胞侵袭和转移的一个必需步骤就是穿越基底膜侵入周围基质。许多研究发现，该过程常伴随着MMP-9表达与活性的增高，这为临床给予早期干预措施提供了重要依据[4]。

本实验从探索EGCG对U87MG细胞MMP-9酶活性的影响入手，研究表明EGCG能抑制PMA诱导的RU87MG细胞MMP-9的活性，且随着EGCG浓度的增加，U87MG细胞MMP-9的酶活性减弱越明显。并从基因转录及蛋白表达水平研究了其可能的机制，研究表明EGCG可以从基因及蛋白水平抑制MMP-9的酶活性，说明EGCG是一种潜在的MMP-9酶抑制剂。GBM的转移、扩散常意味着预后差[6]。了解其转移、扩散的分子机制，采取相应的靶治疗对控制癌细胞的转移，提高晚期患者的生存率有重要的意义。本研究表明EGCG能明显降低MMP-9基因的表达水平和活性，从而发挥其抗肿瘤活性，然而具体的调控机制还有待我们进一步研究。

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[5]师怡,林建银.基质金属蛋白酶抑制剂与肿瘤的相关性研究新进展[J].当代医学,2009,15(18):27-28.

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