鸭肝炎病毒现场分离株单克隆抗体的研制

周珍辉，陈万荣，周育森，向双云，曹金元，李玉冰，杨久仙，曹授俊 ，田璐，张浩

（1.北京农业职业学院 畜牧兽医系，北京 102442；2.中国军事医学科学院 微生物流行病研究所，北京 100071）

Ⅰ型鸭病毒性肝炎（serotypeⅠ duck viral hepatitis，DHV Ⅰ ）由Ⅰ型鸭肝炎病毒引起，以发病急、传播快、病程短、死亡率高为主要特征，临床表现为痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状，主要病变为肝脏出血、坏死和肿胀，是危害养鸭业最严重的疾病之一[1-4]。笔者对分离的DHV进行纯化，并制备单克隆抗体，旨在建立特异性强、敏感性高、简便快速的DHV检测方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

毒株由北京某鸭场分离，经动物试验、鸭胚尿囊腔接种、PCR诊断，确诊为Ⅰ型鸭肝炎病毒[5-6]。试验动物BALB/c小鼠由中国军事医学科学院试验动物中心提供；SP2/0骨髓瘤细胞由中国军事医学科学院分子病原研究室提供；抗体亚类试剂盒购自Gibco公司；10日龄鸭胚及1日龄雏鸭购自北京三江宏利牧业有限公司。

1.2 抗原制备及鉴定

1.2.1 DHV抗原的纯化

将临床发病鸭的肝脏制成悬液，通过尿囊腔接种10日龄鸭胚，收集接种后4～5 d死亡的鸭胚尿囊液，反复冻融后，4 ℃ 6 000 r/min离心，去沉淀，取上清，加等量氯仿，振摇20 min，4 ℃ 6 000 r/min离心，去沉淀，取上清，重复上述过程6次，收集上清液。在收集的上清液中加入10% PEG6000及终浓度为0.4 mol/mL的NaCl，4 ℃磁力搅拌过夜后，4℃1 2 000 r/min离心，去上清，沉淀加少量pH7.4、0.01 mol/mL PBS重悬，再经蔗糖密度梯度超速离心纯化[7]。设30%和60% 2个蔗糖梯度，于10 mL离心管中，每一梯度溶液加4 mL，最后在溶液面上加粗提抗原2 mL，经35 000 r/min离心4 h，分别收集各明显的梯度带。纯化抗原作适当稀释，磷钨酸负染，透射电镜观察病毒粒子的形态及纯度。纯化病毒作免疫原免疫动物用和包被抗原检测抗体用。纯化抗原的蛋白质量浓度为0.77 mg/mL，－80 ℃冰柜冻存备用。

1.2.2 正常尿囊液抗原的制备

在制备DHV尿囊液的同时，取正常14至15日龄鸭胚尿囊液，同步纯化蛋白。除不进行超速离心外，其余按1.2.1的方法进行，检测蛋白质量浓度为1.94 mg/mL，作包被抗原间接ELISA法筛选抗体时排除非特异用，－80 ℃冰柜冻存，作为阴性抗原对照。

1.2.3 纯化抗原的病原性鉴定

将提纯抗原经0.22 µm滤膜处理，接种10日龄鸭胚5枚，对照组鸭胚注射生理盐水，每天照蛋2次，逐日统计鸭胚死亡情况；采取颈背部皮下注射的方式，注射1日龄雏鸭5只，对照组雏鸭注射生理盐水，观察雏鸭发病死亡情况。

1.3 免疫BALB/c小鼠

第1次免疫时取纯化抗原与福氏完全佐剂等量混合，充分乳化后，按每只100 µg（每只0.5 mL）的抗原量，采取腹部皮下两点注射的方式，注射8 周龄BALB/c 雌性小鼠3 只，另取1只小鼠注射生理盐水为对照；2周后取纯化抗原与福氏不完全佐剂乳化后进行第2次免疫，方法与第1次免疫相同；4周后进行第3次免疫，方法与第1次免疫相同；6周后从免疫小鼠和对照小鼠的尾尖采血，分离血清，将纯化的DHV抗原分别以2、5、10 µg/mL包被96孔板，同时用纯化的正常尿囊液蛋白按上述浓度分别包板，用间接ELISA法检测血清中的抗体含量。当免疫小鼠抗体含量较高时，融合前加强一次免疫，直接用纯化抗原经腹部皮下分两点注射免疫小鼠，第4天后取抗体含量最高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选抗体。

1.4 杂交瘤细胞株的融合和筛选

参照文献[8-9]，取抗体含量最高免疫小鼠的脾细胞和处于对数生长期的SP2/0 细胞，按（1∶5）～（1∶10）的比例进行融合，融合后分装5块96孔板，置37 ℃5%CO2培养箱中，用筛选培养基进行培养，1周后改用HT培养基进行培养，每日观察细胞生长状况，7～9 d用间接ELISA法 进行检测筛选。用纯化抗原与纯化正常尿囊液蛋白分别包被96孔板，蛋白浓度为10 µg/mL，每孔100 µL，4 ℃过夜，次日用PBS-Tween-20洗涤3次，每孔加入100 µL初筛抗体，37 ℃作用1 h，用同样的方法洗板3次，加入酶标记的羊抗鼠IgG，37 ℃作用30 min，洗涤3次，加入显色剂显色后，再加终止液终止，用酶标仪测定OD值。选择经纯化抗原检测后OD值较高且与正常纯化尿囊液蛋白无反应的阳性孔进行亚克隆。用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞连续进行3次亚克隆后，上清检测阳性率达100%的单克隆孔进行扩大培养，冻存细胞株，制备腹水。

1.5 腹水的制备、效价检测及特异性鉴定

1） 腹水的制备。参照文献[8]，给每只BALB/c小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡油0.5 mL，2 周后再注射杂交瘤细胞，每株单抗注射4只小鼠，每只0.5 mL，每1 mL含1×106个杂交瘤细胞。2 周左右有腹水产生，抽取腹水，56 ℃灭活冻存，备用。

2） 腹水效价的测定。将纯化抗原与纯化正常尿囊液蛋白包板后，用间接ELISA法检测腹水中的抗体效价。包被用抗原量为10 µg/mL，每孔100 µL。

3） 腹水的特异性鉴定。将腹水1∶100稀释，分别用纯化DHV抗原、正常纯化尿囊液蛋白和乙型肝炎表面抗原（HBS）包板，用间接ELISA法检测。

1.6 单克隆抗体亚类鉴定

用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒测定8株单抗的类型。按说明书，用ELISA法进行检测。

1.7 鸭胚中和试验

采用固定病毒-稀释抗体法[10]进行EID50的测定：取经尿囊腔繁殖的病毒液用PBS进行10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6稀释，每个稀释度尿囊腔接种5枚10日龄鸭胚，7 d内逐日观察鸭胚的死亡情况，计算出200个TCID50的含量。将7株单抗所产生的腹水用滤膜过滤后，用PBS作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32稀释，用含200个TCID50的DHV病毒液分别与7株单抗原液不同稀释度的腹水等量混合，37 ℃作用2 h后，各稀释度尿囊腔接种10日龄鸭胚5枚，0.2 mL/枚，另设5枚接种病毒，作为对照。逐日观察9 d，记录鸭胚死亡情况。

1.8 雏鸭保护试验

1日龄雏鸭分为8组，每组8只，前7组分别颈背部皮下接种DHV-1、DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-9、DHV-10、DHV-11、DHV-12腹水0.5 mL，24 h后接种含毒尿囊液0.2 mL，第8组只接种含毒尿囊液0.2 mL，作为对照。各组鸭分开饲养，连续观察7 d，记录各组鸭的死亡情况。

2 结果与分析

2.1 抗原的纯化及鉴定结果

病毒经冻融氯仿反复处理及离心后，去除了大量的杂蛋白，经PEG-6000 浓缩后，病毒蛋白含量大大提高。浓缩抗原经蔗糖密度梯度离心，共出现了2个明显条带。约位于30%蔗糖梯度间的条带为病毒带。在电镜下可见直径20～40 nm的病毒粒子，呈球形或类球形，颗粒结构清晰，大小、结构均符合Ⅰ型DHV特征（图1）。将纯化抗原接种鸭胚后可导致鸭胚全部死亡，胚体出血明显。攻毒1日龄雏鸭2～3 d后死亡，肝脏上有针尖到米粒大小的出血斑点。

图1 鸭肝炎电镜照片Fig.1 Electricity lens picture of DHV

DHV病毒的纯化方法较多，在前期工作中用硫酸铵沉淀病毒后，发现杂蛋白多，病毒的形态被破坏，结构模糊[11-12]。通过反复冻融，氯仿去脂，PEG沉淀，蔗糖密度梯度离心后，得到了较纯的DHV，电镜下可见大量DHV颗粒，通过鸭胚尿囊腔接种，感染鸭胚全部死亡，说明经过上述纯化后，抗原保持了良好的活性。

2.2 小鼠免疫结果

小鼠三免后采血，纯化抗原包板后，检测出3只免疫小鼠血清抗体的效价为（1∶400）～（1∶16 000），正常小鼠的效价＜（1∶100）。正常纯化尿囊液蛋白包板后，用间接ELISA法检测出3只免疫小鼠及正常小鼠血清抗体的效价均＜1∶100。由此，可以排除分泌针对正常尿囊液抗体的杂交瘤细胞株。10 µg/mL抗原用量包板后所测得的OD值优于2、5 µg/mL的抗原用量，故在进行单克隆抗体的筛选中，将包板的最佳抗原用量定为l0 µg/mL。

免疫小鼠血清抗体含量检测结果显示，用纯化抗原包板检测的OD值显著高于用正常纯化尿囊液蛋白包板所测得的OD值。由此可知，免疫小鼠血清中的抗体主要由注射DHV抗原所致，小鼠免疫效果好，免疫用的DHV抗原纯度较高。

2.3 杂交瘤细胞株的融合和筛选结果

细胞融合经过初次检测，3次亚克隆后，共筛选出阳性杂交瘤细胞8株，分别命名为DHV-1、 DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-9、DHV-10、DHV-11、DHV-12。在亚克隆过程中，有DHV-2、DHV-3、DHV-4、DHV-5共4株杂交瘤细胞分泌抗体特性丢失。DHV-1、DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-9、DHV-10、DHV-11、DHV-12经过多次传代、冻存复苏后，保持了稳定分泌抗体的功能。在初次筛选时，选用OD值0.5以上的阳性孔进行亚克隆，这样可以更多地筛选出阳性的杂交瘤细胞株而不致于丢失。正常纯化的尿囊液以10 µg/mL包板筛选单克隆抗体时，OD值均为0.01～0.10，因此，筛选阳性孔时基本排除了非特异性反应。

2.4 腹水的效价及特异性鉴定结果

正常纯化尿囊液蛋白包板后，用间接ELISA法检测8株单抗腹水中的抗体效价均＜（1∶100）。将纯化抗原包板后，用间接ELISA法检测8株单抗腹水中的抗体效价，DHV-7、DHV-8为1∶1 000，DHV-6、DHV-10为1∶8 000，DHV-1、DHV-9、DHV-11和DHV-12为（1∶32 000）～（1∶512 000）。由此可知，腹水中的抗体主要是针对DHV抗原产生的。经间接ELISA法鉴定，所制备的单克隆抗体与乙型肝炎表面抗原、正常纯化尿囊液蛋白无交叉反应，表明所制备的杂交瘤细胞具有良好的特异性。

2.5 单克隆抗体亚类鉴定结果

经MAb亚类鉴定，所获得的杂交瘤细胞株DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-10为IgG1亚类，DHV-1、DHV-12为IgG2a亚类，DHV-2、DHV-9、DHV-11为IgG2b亚类，轻链均为k链。

2.6 鸭胚中和试验结果

接种病毒的鸭胚在接种后3～4 d全部死亡。DHV-6、DHV-7、DHV-9、DHV-10能原倍中和病毒，2倍稀释后中和保护率为50%，各稀释度均能明显延缓鸭胚的死亡。DHV-1、DHV-8、DHV-11、DHV-12原倍中和的保护率为50%，各稀释度均能明显延缓鸭胚的死亡。

2.7 雏鸭保护试验结果

保护试验结果显示，DHV-6、DHV-7、 DHV-9、DHV-10单抗对雏鸭的保护率为50.0%～62.6%。DHV-1、DHV-8、DHV-11、DHV-12 4株单抗对雏鸭的保护率差，在25%以下。

3 结论与讨论

正常鸭胚尿囊液中的混杂物很多，需对尿囊液中的病毒进行纯化。本研究中，在抗原纯化、小鼠免疫、杂交瘤细胞株的融合筛选、腹水效价检测试验中，均以正常尿囊液作对照，免疫用的DHV抗原纯度较高，排除了非特异性反应。在试验过程中，为防止细胞的突变返祖，确保骨髓瘤细胞对HAT的敏感性，每3～6个月应用8-氮杂鸟嘌呤（8-AG）筛选1次。细胞融合后第1次克隆化的时间应尽可能早，越早越不容易丢失阳性克隆。要尽早检测，以确定细胞融合后的克隆是否分泌特异性抗体。一旦检测为阳性，则不论其细胞克隆的大小，应立即进行克隆化，这是保证克隆化成功、获得稳定分泌McAb杂交瘤细胞系的非常重要的一环。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

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英文编辑：罗文翠