猪繁殖候选基因HoxA10的克隆及表达分析

周晓宁，方梅霞，何小梅，聂庆华*，张细权

（1.华南农业大学 动物科学学院，广东 广州 510642；2.广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，广东广州 510642；3.暨南大学 医学院，广东 广州 510632）

HoxA10是同源框基因（HomeoBox,Hox） 亚类腹 B（AbdB）基因成员之一[1]，在生殖与胚胎着床、发育等方面有重要作用。HoxA10基因敲除小鼠的子宫输卵管连接处消失，子宫近侧25%部分呈输卵管状狭窄卷曲[2]。Satokata等[3]的研究证实了这一点，HoxA10（–/–） 小鼠可以存活，但由于子宫内膜缺乏胚胎着床环境，子宫内膜不能进入容受状态，导致胚胎死亡，表现为不孕。雄性动物的研究也显示出生殖障碍。Benson 等[4]发现，HoxA10（–/–） 突变雄鼠出现双侧隐睾和副性器官以及精子发育障碍等形态异常，可见，HoxA10基因在生殖器官的完整发育以及胚胎着床过程中有重要的调控作用，是动物繁殖性状的重要候选基因。近年来，对HoxA基因的研究主要集中在对人和啮齿类的研究中。人HoxA10基因定位于染色体7p15.3[2]。在成人子宫内膜，HoxA10的表达依赖于月经周期，是子宫蜕膜化过程的一个关键因素[5]。李红等[6]发现，HoxA10基因在正常育龄妇女和不明原因不孕患者的增殖早、晚期及分泌早期，子宫内膜腺上皮和间质均有表达，相互之间无显著差异，但在分泌中、晚期，正常育龄妇女子宫内膜的腺体和间质HoxA10基因mRNA有显著高表达。关于啮齿类的研究[2]表明，小鼠HoxA10基因定位于6号染色体。在小鼠胚胎发育过程中，HoxA10基因在苗勒管和成熟子宫内膜中均有表达[7]。桂耀庭等[8]发现，在正常人和隐睾症患者的睾丸组织中，HoxA10均有表达，但是与正常人相比，HoxA10基因在隐睾症睾丸组织的表达显著降低。HoxA10基因在生殖与胚胎着床、发育等方面有重要的作用， 对HoxA10基因的研究有利于了解猪的繁殖性状，进而提高猪的繁殖性能。目前对猪HoxA10基因的研究较少[9]，对猪HoxA10基因的序列、结构等相关信息都还缺乏研究。笔者在对猪HoxA10基因生物信息学进行分析的基础上，用RT-PCR、Real-Time PCR等方法，研究该基因的克隆及表达，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

于广东省农业科学院畜牧研究所随机选取120日龄长白母猪1头，放血屠宰后，立即采集垂体、大脑、小脑，丘脑、卵巢、肺、胃、背肌、大肠、腹脂、肝、后肌、淋巴、脾、前肌、肾、输卵管、小肠、子宫、背膘等组织，－80 ℃保存。子宫组织用于HoxA10基因cDNA序列扩增，所有组织用于基因表达规律分析。

1.2 猪HoxA10基因预测

将人HoxA10基因 cDNA序列（GeneBank NM_153715.3）与猪全基因组序列比对，定位猪HoxA10基因。根据人HoxA10基因信息及外显子-内含子交接的GT-AG规则，对猪HoxA10基因进行预测，并对外显子进行拼接，最终获得猪HoxA10基因的预测cDNA序列及可能的基因结构。

1.3 引物设计

根据预测的猪HoxA10基因cDNA序列，共设计了3对引物（表1）。P1用于猪HoxA10基因cDNA序列扩增；qs-hoxa用于该基因各组织表达分析，qs-actin为内参基因β-actin引物。所有引物均使用Genetool软件设计，送由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 各引物基本信息Table 1 Descriptions of the 3 primers used in this study

1.4 HoxA10基因 cDNA序列扩增

用常规Trizol方法，抽提猪各组织中总RNA，用 TOYOBO公司的反转录试剂盒将各组织的总RNA反转录成cDNA，并以看家基因（β-actin）引物扩增，验证反转录是否成功，将反转录产物－20 ℃保存备用。以子宫cDNA为模板，RT-PCR 扩增HoxA10基因cDNA序列，10 µL反应体系中包括：0.4 µL cDNA、0.25UTaqDNA polymerase （东盛生物）、12.5 pmol P1或P2、5 µL 2×PCR Reaction Mix，其余用ddH2O补齐。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，32个循环，最后72℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶纯化后连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，进行克隆测序。

1.5 猪HoxA10基因序列分析与功能预测

1.5.1 物种间HoxA10基因CDS的同源性分析

登录NCBI的BLAST程序[10]，在GenBank数据库选择“Nucleotide blast”，将所得到的猪HoxA10基因CDS序列输入NCBI/Blast软件的序列输入框内，选择程序“Megablast”进行同源性检索；采用DNAstar软件中的MegAlign对猪HoxA10基因CDS序列与 BLAST得到的其他物种的HoxA10基因CDS序列（图2）进行同源性比对。

1.5.2 蛋白质功能预测

采用 ExPASY的 ComputepI/MW 程序和SAPS（statistical analysis of protein sequences），对HoxA10基因蛋白序列的相对分子质量、氨基酸组成、等电点进行分析。

采用网上的motif数据库进行motif、结构位点、机构功能域功能预测。

1.5.3 9个物种HoxA10基因的系统进化分析

利用MEGA3.1程序，对不同动物HoxA10或pHoxA10基因的核苷酸序列进行BLAST分析，再计算物种间的同源距离，并通过邻近归并法构建物种间系统发生树。

1.6 荧光定量PCR

选用SYBR Green PCR Master Mix（TOYOBO，Japan）试剂盒，用 ABI PRISM®7500 Sequence Detection System（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）分析仪对各组织HoxA10基因mRNA丰度进行定量检测。不同组织的HoxA10基因mRNA拷贝数使用β-actin作为内参进行校正。目的基因荧光定量PCR引物为qs-hoxa，内参基因的引物为qsactin。采用20 µL反应体系，其中包括5 µL cDNA模板，10 µL 2 × Q-PCR SYBR Green Mix，0.5 µL的上下游引物，其余用蒸馏水补齐。每个样本设3个重复，分别使用引物qs-hoxa和qs-actin进行扩增。PCR按 ABI公司提供的程序和优化后的退火温度进行。PCR产物特异性使用溶解曲线判定。每个组织HoxA10基因 mRNA的相对表达量用 2-ΔΔCt表示，其中，ΔCt=目的基因Ct- 内参Ct；ΔΔCt=待测样品中目的基因ΔCt- 参照样品中目的基因ΔCt（若无参照样品则选择ΔCt最大的样品为参照进行计算，本试验中以脾脏中目的基因ΔCt为参照） 。

2 结 果

2.1 猪HoxA10 cDNA克隆

对猪HoxA10基因预测的结果显示，HoxA10基因位于猪18号染色体正链44195018—44204802，由2个外显子和1个内含子组成，cDNA序列长2 247 bp，预计编码合成94个氨基酸残基。RT-PCR结果显示，从猪子宫组织中克隆获得HoxA10基因cDNA长538 bp，包括1个285 bp的开放阅读框，共编码合成94个氨基酸残基（图1），与预测相同。

图1 猪HoxA10基因cDNA序列Fig. 1 cDNA sequence of pig HoxA10 gene

2.2 猪HoxA10基因序列分析与功能预测

2.2.1 物种间HoxA10基因CDS的同源性分析

从NCBI网站收集了9个物种HoxA10基因的CDS及氨基酸序列（表 2）。用 DNAstar软件中的MegAlign对各序列间的同源性进行分析（表3），发现猪的CDS与牛的同源性最高，达到94.7%；猪的CDS与人和小鼠的同源性分别为90.9%和90.5%；氨基酸同源性比对显示，猪与人、牛的氨基酸同源性达到了98.9%，与小鼠的同源性为97.9%。

表2 9个物种HoxA10的蛋白质和cDNA序列Table 2 Protein and cDNA sequences of HoxA10 among 9 species

表3 不同物种HoxA10基因CDS序列及氨基酸序列的同源性比较Table 3 Homology of HoxA10 CDS and its amino acid sequences among different species

2.2.2 蛋白质功能预测

猪HoxA10蛋白序列的相对分子质量、氨基酸组成、等电点的分析结果显示，HoxA10蛋白相对分子质量为1.15×104，在94个氨基酸残基中共包含22个强正极性氨基酸（如K、R），9个强负极性氨基酸（如D、E），等电点为10.60，推测为一个碱性氨基酸。

2.3 9个物种HoxA10或pHoxA10基因的系统进化分析

聚类分析显示，9个物种被划分为界线清晰的4个类群，狨猴、狒狒、人等灵长类聚为一类，狗和小鼠聚为一类，鸡和斑马鱼各自成一类（图2）。

图2 9个动物种的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree among 9 animal species

2.4 猪HoxA10基因组织表达

猪HoxA10基因在很多组织都有表达，其中，前肌的表达量最高，腹脂、后肌、肾、大肠、输卵管、子宫也有较高的表达，脾、淋巴、肝、小肠的表达较低。另外，垂体、大脑、小脑、丘脑、卵巢、肺、胃、小肠、背肌、背膘等10种组织中，HoxA10的表达很低或无表达。

3 讨论与结论

本试验中从猪的子宫组织中克隆了HoxA10基因的cDNA，其序列长538 bp，包括一个285 bp的ORF（开放阅读框），编码94个氨基酸残基；144 bp的5'UTR和109 bp的3'UTR；该基因在猪各组织中均有表达，以前肌的表达量最高；其次为肾、子宫、后肌、输卵管等组织；脾、淋巴、肝、小肠的表达较低；在垂体、大脑、小脑、丘脑、卵巢、肺、胃、小肠、背肌、背膘等组织中基本无表达。HoxA10基因在生殖系统的发育以及胚胎着床等生殖过程中有重要作用。HoxA10基因敲除的雌性小鼠会出现胚胎着床障碍，雄性小鼠会出现双侧隐睾和副性器官以及精子发育障碍等；因此，推测HoxA10基因在胚胎形成过程中参与调节泌尿生殖管的发育，也是维持个体生殖力的重要因素[11]。通过对本试验获得的HoxA10序列进行分析，结果显示，该基因的 CDS与牛的同源性最高，达到94.7%；与人和小鼠的同源性分别为90.9%、90.5%。聚类分析也显示，猪与牛的亲缘关系最近，与斑马鱼亲缘关系较远。9个物种的HoxA10氨基酸序列系统进化树也与几类动物（灵长类、低等哺乳动物、禽类、鱼类）的分类学及人类对于动物进化的认识一致；因此，所获序列为猪HoxA10基因序列，与预测的结果相同。据报道，在人和小鼠中，HoxA10基因均有2个转录本，本试验中只利用人的其中一种转录本为参照进行猪HoxA10基因的序列预测。同样，根据人HoxA10基因的另一种转录本进行预测，猪HoxA10基因也与人和小鼠一样存在另一种转录本，本课题组拟对此预测结果进行验证。

从基因的表达规律看，HoxA10基因在猪的各组织中分布不是很广泛，以前肌的表达量最高，肾、子宫、后肌、输卵管等组织也有较高的表达。Blitek等[12]用促性腺激素诱导猪动情，检测猪早期妊娠在第10、11、12、15 d中HoxA10基因在子宫内膜和孕体中的表达，发现HoxA10的表达在第12天和第15天均明显上调，表明HoxA10基因在成年猪的子宫内膜是有表达的。Taylor等[7]也发现，在小鼠胚胎发育过程中，HoxA10基因在苗勒管和成熟子宫内膜中均有表达。本研究结果也显示，猪HoxA10基因在子宫和输卵管中也有较高的表达，与人和小鼠等类似。猪HoxA10基因在肾中表达较高，预示该基因参与调节泌尿生殖管的发育。猪HoxA10基因在子宫和输卵管的较高表达，表明该基因与猪的繁殖性状有显著的相关性，可能是影响猪生殖调控以及与繁殖性状相关的重要的候选基因。

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英文编辑：罗文翠